获得单拷贝目的基因表达框整合之安全转基因植物的方法技术

本发明专利技术公开了一种获得单拷贝目的基因表达框整合之安全转基因植物的方法，包括以下步骤：1)、植物抗性标记基因诱导剪切表达载体的构建；2)、外源基因序列DNA片段的制备；3)、DNA微弹载体悬液制备；4)、植物愈伤组织基因枪轰击转化；5)、抗性愈伤组织的筛选；6)、直接在抗性愈伤组织预分化或分化阶段进行重组酶诱导表达对标记基因相关序列进行剪切处理；7)、转基因植株的分子检测；8)、单拷贝目的基因表达框整合的转基因植株的获得和分子鉴定：对上述步骤挑选出的转基因植株，采用Southern杂交技术鉴定目的基因表达框整合的拷贝数，确定单拷贝整合的转基因植株。

【技术实现步骤摘要】

专利技术涉及一种利用基因枪介导外源基因表达载体片段转化植物的方法，此方法获得的转基因植株除目的基因外不含多余垃圾DNA，而且外源目的基因为单拷贝整合，是一种植物转化技术。属于生物学领域，特别涉及到基因工程技术。
技术介绍
自1983年第一例转基因植物诞生以来，植物基因导入技术日臻完善，形成了以基因枪和农杆菌两大转化技术为主体的植物基因转化系统。随着转基因农作物的商品化种植，转基因植物潜在的生态环境危害以及由之而来的遗传修饰食品对人类的食用安全性， 已成为转基因农作物推广应用的重要障碍。转基因植物中存在的抗性选择标记基因是导致转基因植物安全性问题的根源之一。转基因植物中的抗性选择标记基因在植物转化过程中用来区分转化和非转化细胞，赋予转化细胞对除草剂或抗生素抗性的抗性标记基因是植物转化中普遍使用也是最有效的筛选标记基因，对植物细胞转化处理后，通过在培养基中加入相应的除草剂或抗生素对细胞进行筛选来获得转化细胞。由于目前的基因导入技术只能将外源基因导入少数细胞中， 所以在导入目的基因的同时必须引入抗性选择标记基因才能实现对植物细胞的有效转化。 转基因植株再生后，这些抗性选择标记基因通常不再具有应用价值，但除草剂抗性基因可能通过基因漂移传递给近缘物种，产生恶性杂草，对生态环境造成危害；抗生素抗性基因可能通过基因漂移转移给土壤微生物或通过食物链转移至人类肠道微生物，使人对相应抗生素产生抗性，影响人类健康。因此如何在植物转化成功后田间释放前剔除抗性选择标记基因解决转基因植物安全性问题的必要程序。目前通常将抗性标记基因与目的基因共转化，筛选获得转基因植株后再剔除标记基因是获得无选择标记基因的转基因植物的有效途径。已经建立的标记基因剔除系统主要包括四种转座子介导目的基因再定位系统、共转化和遗传分离系统、重组酶介导标记基因剪切系统和依赖染色体内同源重组的标记基因切除系统(Sreekala C，Wu L，Gu Wang D, Tian D Excision of a selectable marker in transgenic rice(Oryza sativa L.) using a chemically regulated CRE/loxP system. Plant Cell Rep，2005，24 :86_94)。其中基于Pl噬菌体Cre/loxP系统发展的标记基因剪切系统应用最为广泛。1991年，Dale 和Ow首次利用重组酶Cre可将位于两个同向排列的1 οχΡ位点之间的外源DNA序列选择性地切除这一特性，通过重组酶Cre基因二次转化获得完全剔除了筛选标记基因的转基因烟草植株(Dale EC, Ow DW(1991) Gene transfer with subsequent removal ofthe selection gene from the host genome. Proc Natl Acad Sci USA 88:10558-10562)。 近年来，利用Cre/loxP这一系统消除标记基因得到了快速发展。2000年，Zuo等建立了一种化学诱导植物基因表达系统XVE，雌激素诱导驱动Cre基因的表达，将雌激素诱导Cre 基因表达系统和抗性标记基因同置于两个正向排列的LoxP位点之间，设计构建了雌激素诱导的标记基因诱导剪切系统，成功实现了转基因植物中抗性标记基因和为了切除抗性标记基因而引入的Cre基因表达序列(简称为抗性标记基因相关序列，resistant marker gene related sequences，缩写为 RMGRS)的一次性可控删除(^io J, Niu Qff, Chua NH. An estrogen receptor-based transactivator XVE mediates highly inducible gene expression in transgenic plants. Plant J，2000，24 :265-273)。随后基于上述思路， 研究者又发展了一些新型诱导表达型启动子如玉米乙酰苯胺类化合物瞬间诱导启动子 (In5-2)(Yuan Y， Liu YJ, Wang Τ.ANew Cre/lox System for Deletion of Selectable Marker Gene. Acta Botanica Sinica，2004，46 (7) :862-866.)、热诱导启动子(Cuellar W, Gaudin A， Solorzano D， Casas A， Nopo L， Chudalayandi P， Medrano G， Kreuze J， Ghislain M. Self-excision of the antibiotic resistance gene nptll using a heat indueibleCre-loxP system from transgenic potato. Plant Mol Biol 2006，62 :71-82) 和地塞米松诱导启动子(李文旭，基于Cre/loxP系统诱导删除抗生素基因植物表达载体的构建，硕士学位论文，福建农林大学，2009，P16-17)等来诱导Cre基因表达以实现转基因植物中RMGRS的一次性可控删除。但上述研究技术存在的缺陷有两个(1)对RMGRS的剪切处理大多在转基因植株水平上，由于Cre基因表达重组酶只能切除同置于两个正向排列的LoxP位点之间序列，而转基因过程中外源基因的整合通常比较复杂，可能存在多拷贝整合以及或外源基因片段的截断和重组等，因此诱导剪切前需要对转基因植株进行Southern杂交分析，挑选出外源基因单拷贝整合的株系进行标记基因诱导剪切处理，而且需要对候选植株整株喷施一定量的雌激素，持续诱导很多天才能得到 RMGRS成功切除的转基因株系，这不仅成本高，时间长，程序复杂，而且还有可能产生标记基因不完全切除的嵌合体。而传统的标记基因诱导剪切处理均在转基因植株水平上，诱导剪切前需要对转基因植株进行Southern杂交分析，挑选出外源基因单拷贝整合的株系进行标记基因诱导剪切处理，成本高，时间长，程序复杂，而且可能产生标记基因不完全切除的嵌合体。(2)上述植物RMGRS诱导剪切系统均采用农杆菌介导转化法，无法消除转化质粒载体框架DNA序列的污染。已有大量研究证据表明，在农杆菌介导转化的转基因植株中载体框架序列的整合现象普遍存在。质粒载体框架序列不可避免地含有允许基因构建体在大肠杆菌中或农杆菌中克隆的抗生素抗性选择标记和复制起点，具有向外界环境中逃逸的潜在危险性(Fu Xiangdong, et al. Linear transgene constructs lacking vector backbone sequences generate low-copy-number transgenic plants with simple integration patterns. Transgenic Research, 2000,9 :11_19)，是目前公认的导致转基因植物安全性问题的根源之二。基因枪法可将去除质粒载体框架序列的外源基因表达框(仅本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵艳，钱前，郭龙彪，黄大年，
申请(专利权)人：浙江工商大学，中国水稻研究所，
类型：发明
国别省市：