检测喹噁啉-2-羧酸残留的免疫胶体金试纸及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种检测喹噁啉-2-羧酸残留的免疫胶体金试纸及其制备方法。本发明专利技术应用免疫学技术筛选出抗喹噁啉-2-羧酸的多克隆抗体，通过胶体金的制备及胶体金标记条件的探索研究，在应用抗喹噁啉-2-羧酸多克隆抗体和GICA技术研究建立抗喹噁啉-2-羧酸多克隆抗体快速检测试纸，并对其性能进行测定。试纸检测范围较宽，假阳性低，检测灵敏，检测结果准确、可靠，适用于动物源性食品中的可食性组织如肌肉、肝脏等组织中喹噁啉-2-羧酸残留的检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种兽药残留免疫化学快速检测
，具体涉及喹噁啉-2-羧酸 (QCA)残留的免疫胶体金试纸及其制备方法。
技术介绍
卡巴氧作为抗菌促生长剂，广泛应用于畜禽养殖，能促进动物生长、提高饲料转化率、预防和控制猪痢疾和细菌性肠炎。代谢研究和毒理学研究表明，卡巴氧在猪体内迅速转化成脱一氧和脱二氧化合物，其原形和脱氧化合物对人和动物有一定的毒性作用，主要表现为诱癌性、致突变作用、繁殖毒性。因此，1999年欧盟禁止卡巴氧在食品动物中应用， 2001年加拿大也颁布法令禁止卡巴氧在市面上销售，2003年食品添加剂联合专家委员会 (JECFA)对卡巴氧进行了再评价，委员会决定对卡巴氧撤销其最大残留限量(MRLs)，该残留限量由JECFA于1999年规定，肌肉和肝脏分别为5和30 μ g/kg。喹噁啉-2-羧酸是卡巴氧在猪体内最稳定的代谢产物，被欧盟法定为卡巴氧在猪食用组织中的残留标识物。目前在动物性食品中喹噁啉-2-羧酸的分析检测方法有很多，包括高效液相色谱法(HPLC)、 液质连用(LC-MS)、气质连用(GC-MS)和ELISA。仪器检测主要存在仪器购置费用昂贵、样品前处理复杂、程序繁琐费时、检测费用高、不能现场操作等缺陷，所以在生产中应用受到限制。ELISA方法灵敏度高、成本低，在药物残留检测中应用也很广泛，但该方法需要酶标仪等实验室设备，分析时间长，难于应用与现场应用等局限性。近年来，胶体金免疫层析技术(GICA)与目前普遍采用的标记免疫分析技术相比，具有简便快速，特异性强、敏感性高， 肉眼判断，实验结果易保存，无需特殊仪器设备等优点，因此GICA技术在药物残留检测领域得到了广泛应用。目前还没有针对喹噁啉-2-羧酸残留检测的免疫胶体金试纸及其制备方法的专利和文献报道。
技术实现思路
为解决以上技术问题，本专利技术的目的之一在于提供一种能快速检测、准确可靠检测喹噁啉-2-羧酸残留的免疫胶体金试纸本专利技术的的之二在于提供一种能快速检测、准确可靠检测喹噁啉-2-羧酸残留的免疫胶体金试纸的制备方法。本专利技术目的之一是这样实现的一种检测喹噁啉-2-羧酸药物残留的免疫胶体金试纸，包括背板(2)，该背板⑵上设置手控区、测试区和样品端，所述测试区位于背板(2) 中部，所述手控区和样品端位于背板(2)两个端部，其关键在于所述手控区由吸水垫(3) 和手控区封膜(I)组成，所述吸水垫(3)粘附在背板(2)，该吸水垫(3)上表面及外端面和背板(2)外端面粘附手控区封膜(I)，所述测试区为粘附在背板(2)上的硝酸纤维素膜(4)，所述硝酸纤维素膜(4)上包被有羊抗兔IgG的质控线(5)和喹噁啉-2-羧酸-牛血清白蛋白偶联物的检测线(6)，所述样品端由结合垫(7)、样品垫⑶和样品端封膜(9)组成， 所述背板(2)上由测试区到外端依次粘附结合垫(7)和样品垫(8)，该样品垫(8)搭在结合垫(7)上，所述样品垫(8)上表面及外端面和背板(2)外端面粘附样品端封膜(9)。本专利技术目的之二是这样实现的检测喹噁啉-2-羧酸药物残留的免疫胶体金试纸的制备方法，其特征在于按如下步骤进行步骤一将半抗原喹噁啉-2-羧酸与牛血清白蛋白偶联合成偶联物免疫原，待用；步骤二 将步骤一中的偶联物免疫原免疫兔，得到特异性抗兔抗喹噁啉-2-羧酸的多克隆抗体，将多克隆抗体加入胶体金中得到抗喹噁啉-2-羧酸多克隆抗体-胶体金标记物，将抗喹噁啉-2-羧酸多克隆抗体-胶体金标记物包被在结合垫(7)上；步骤三将步骤一中的偶联物免疫原包被在硝酸纤维素膜(4)得到检测线检测线(6)，将羊抗兔IgG包被在硝酸纤维素膜(4)得到质控线(5)；步骤四将受控区封膜(1)，吸水垫(3)，硝酸纤维素膜(4)，结合垫(7)，样品垫(8)和样品端封膜(9) 一次粘贴在背板上，得到检测喹噁啉-2-羧酸药物残留的免疫胶体金试纸。本专利技术中的吸水垫、硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫等均购自Millipore公司。本专利技术选用样品区的结合垫(7)包被胶体金标记好的抗QCA多克隆抗体，测试区的检测线(6)为QCA-BSA，控制线为羊抗兔IgG。金标QCA多抗因为毛吸作用随样品流向测试区的检测线和控制线，如果样品中没有QCA存在，测试区的QCA-BSA就可以结合QCA金标多抗，检测线和控制线都显红色，表明阴性结果。如果样品中有QCA存在，QCA就和测试区的QCA-BSA竞争地结合QCA金标多抗，若有足量的QCA存在时，就竞争性地阻止QCA金标多抗和QCA-BSA的结合，检测线不显色，控制线显红色，表明阳性结果。如果检测线和控制线都不显色，表示检测的方法不正确或者试纸失效，须重新使用新的试纸检测。QCA试纸可以用于检测样品中的QCA。取不超过80 μ L的样品加至96孔板上，室温下把试纸样品端浸入样品10-20秒后取出水平放置，只有控制线显色表明阳性。检测线和控制线都显色表明阴性。有益效果本专利技术的检测喹噁啉-2-羧酸残留的免疫胶体金试纸，具有特异性强， 灵敏度高，检测时间短等优点；本专利技术的检测试纸不需要特殊仪器、设备，检测成本低，可现场操作；本专利技术的检测试纸操作简便，不需由专业人员操作；本专利技术检测试纸存储方便，对温度要求不高，室温可保存八个月，4-8°C保存，有效期一年。说明书附I为本专利技术检测喹噁啉-2-羧酸残留的免疫胶体金试纸结构示意图；图2为本专利技术胶体金检测试纸结果判断示意图；图3 :本专利技术胶体金检测试剂盒机读标准曲线示意图；图4为本专利技术胶体金检测试纸目测结果示意图。具体实施例方式下面通过实施例对本专利技术作进一步说明，但不以任何形式限制本专利技术。实施例如图I所示，一种检测喹噁啉-2-羧酸药物残留的免疫胶体金试纸，背板2上设置手控区、测试区和样品端，所述测试区位于背板2中部，所述手控区和样品端位于背板2两个端部，其特征在于所述手控区由吸水垫3和手控区封膜I组成，所述吸水垫3粘附在背4板2，该吸水垫3上表面及外端面和背板2外端面粘附手控区封膜1，所述测试区为粘附在背板2上的硝酸纤维素膜4，所述硝酸纤维素膜4上包被有羊抗兔IgG的质控线5和喹噁啉-2-羧酸-牛血清白蛋白偶联物的检测线6，所述样品端由结合垫7、样品垫8和样品端封膜9组成，所述背板2上由测试区到外端依次粘附结合垫7和样品垫8，该样品垫8搭在结合垫7上，所述样品垫8上表面及外端面和背板2外端面粘附样品端封膜9。I、喹噁啉-2-羧酸(QCA-载体蛋白偶联物的制备免疫原(QCA-BSA)的合成准确称取喹噁啉_2_羧酸348mg溶解在2mLN，N- 二甲基甲酰胺中，搅拌下逐滴加入Y-氨基丁酸溶液，搅拌反应3h，调节反应液pHIO左右。离心除掉沉淀物。将上述反应物逐滴加入BSA溶液中(340mgBSA溶于5mL生理盐水)，再加入 N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 23mg，N, N-二环己基碳二亚胺(DCC) 43. 4mg，4°C反应过夜，离心除去沉淀，取上清液用磷酸缓冲液(PBS)透析3d，每6h更换透析液，将所得产物低压冻干， 于-20°C保存备用。免疫原(QCA-OVA)的合成准确称取喹噁啉_2_羧酸348mg溶解在2mLN，N- 二甲基甲酰胺中，搅拌下逐滴加入Y-氨基丁酸溶液，搅拌反应3h，调节反应液pHIO左右。离心除掉沉淀物。将上述反应物逐滴加入OVA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：乐涛，贾渝跃，徐建，何红秋，牛晓东，
申请(专利权)人：重庆市科学技术研究院，
类型：发明
国别省市：