本发明专利技术涉及一种利用工程大肠杆菌合成C8:0/C10:0/C12:0/C14:0中链脂肪酸及其乙酯的生产方法。具体步骤为：将萼距花属植物/月桂树/香樟中具有不同特异性硫酯酶基因chFatB/ucFatB/ccFatB克隆至表达载体pETDuet-1中得到相应重组质粒。将重组质粒转入大肠杆菌BL21，IPTG诱导表达，表达的硫酯酶特异性水解特定链长的脂酰ACP得到中链脂肪酸；分别将不动杆菌中酰基转移酶基因atfA克隆至表达载体pETDuet-chFatB/pETDuet-ucFatB/pETDuet-ccFatB中得到相应重组质粒。将重组质粒转入大肠杆菌BL21，IPTG诱导表达，共表达的酰基转移酶利用外源性流加的乙醇与中链脂肪酸在胞内形成的脂酰-CoA发生酰基转移反应合成脂肪酸乙酯，得到利用重组大肠杆菌直接合成中链脂肪酸及其乙酯的工艺路线。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物化工领域，特别涉及一种C8:0/C10:0/C12:0/C14:0中链脂肪酸及其乙酯的生产方法。
技术介绍
生物柴油作为化石能源的可替代品，具有安全、可生物降解、燃烧完全等优点，已受到许多国家的高度关注与重视。2010年，全球生物柴油产量约为1700万吨，并呈现持续增长的趋势。目前，生物柴油主要利用动、植物油脂、油脂精练后的下脚料、油泥以及城市潲水油、油炸食品后的废油等，经改性处理，在催化剂催化下与短链醇如甲醇或乙醇等复合而成。生物柴油的主要成分是脂肪酸短链酯，如脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯等。原料成本和生产工艺是制约生物柴油生产的两大因素。生物柴油的生产原料目前大多是采用植物油脂和少量动物油脂，如豆油(主要是美国采用)、菜籽油(欧洲采用)、棕榈油(印度尼西亚)和废油(日本)等。我国主要使用地沟油和酸化油作为原料生产生物柴油(谭天伟等，2002)。原料不足是制约生物柴油规模化生产的关键因素，原料成本已占生物柴油生产成本的75%以上，而且，大量种植含油植物存在与农业争地、破坏生物多样性等问题。自20世纪90年代以来，利用微生物或藻类发酵生产油脂成为燃料油脂研究的重要方向和热点领域。清华大学吴庆余等利用氮限制培养异养微藻脂，油脂含量达到50%以上，但微藻培养存在生物量小(10-20g/L)、培养周期长等不足，而微生物具有代谢旺盛、培养周期短、易于实现大规模生产等优点。通过优化发酵工艺，微生物的油脂产量可达菌体干重的50-70% (施安辉等，2003 ;Papanikolaou S et al.，2004)。微生物油脂在脂肪酸组成上同植物油相似，是生产生物柴油的潜在原料。利用微生物培养生产油脂，是可持续发展的必然，也必将成为生物柴油合成的新方向(赵宗保，2005 ;黄英明等，2006 ；Eric J. Steen et al. , 2010)。目前国内生物柴油主要原料来自地沟油，主要组分是长链脂肪酸(C16:0-C18:0)， 低温性能较差，不适合我国北方地区的冬季使用。添加部分中链脂肪酸乙酯可以有效改善生物柴油的低温性能，扩大其使用范围。另外，中链脂肪酸(C8:0-C14:0)亦用于化妆品、润滑油基础油等，应用范围广，市场前景大。但目前中链脂肪酸多为从植物种子提取，来源有限，而且价格较高。微生物油脂多为胞内产物，必须从组织、细胞中分离后，才能用于油脂原料及生物柴油生产，而且长链脂肪酸居多，这一过程关系油脂成分及生物柴油的质量与成本。随着现代分子生物学尤其合成生物学的发展，通过基因工程的手段，调控脂肪酸合成的相关酶的表达，增加特异性链长脂肪酸的产量，进而合成脂肪酸乙酯，是微生物合成特定油脂及生物柴油的前沿技术。该方法既可以解决生物柴油的原料问题，又可以解决生产工艺步骤多、酶易失活等问题。与其它菌株相比，大肠杆菌具有遗传背景清楚、易于改造、生长速度快、适合高密度发酵等优点，是微生物法合成化学品和燃料的理想菌株。利用大肠杆菌生产高附加值脂肪酸和生物柴油是不争地、不靠天、可持续生产的新途径。与公知技术相比，本专利技术具有以下优点(I)微生物油脂及生物柴油发酵生产周期短，不受场地、季节等因素的影响，不占用耕地资源，容易实现工业化生产。(2)脂肪酸及脂肪酸乙酯以游离方式分泌到细胞外，便于分离。(3)发酵液得到了高浓度的中链游离脂肪酸，克服了生物柴油生产中原料油脂的高成本、胞内油脂不易分离的问题。(4)直接发酵得到高浓度的脂肪酸乙酯，克服了生物柴油生产工艺复杂、成本高的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用重组大肠杆菌(Escherichia coli)直接合成脂肪酸及其乙酯的可再生能源工艺路线，使微生物可以作为细胞工厂直接发酵生产脂肪酸及其乙酯。本专利技术首次采用三种植物萼距花属植物(Cuphea hookeriana) /月桂树 (Umbellularia californica)/ 香樟(Cinnamomum camphora)中具有不同特异性FAT (fatty acyl-acyl carrier protein thioesterase)家族中的硫酯酶基因 chFatB/ucFatB/ccFatB 来构建工程菌，即将基因chFatB/ucFatB/ccFatB克隆至表达载体pETDuet_l中，得到重组质粒pETDuet-chFatB/pETDuet-ucFatB/pETDuet-ccFatB。将重组质粒分别转入大肠杆菌 BL21 (DE3)中，IPTG诱导重组质粒表达，表达的硫酯酶特异性水解特定链长的脂酰ACP，即可分别制得C8:0-C10:0/C12:0/C14:0中链脂肪酸，其中pETDuet-chFatB重组大肠杆菌所产C8:0和ClO: O脂肪酸所占比例为5. 42 %与12. 6 % ；PETDuet-ucFatB重组大肠杆菌所产 C12:0脂肪酸所占比例为34. 52% ；PETDuet-ccFatB重组大肠杆菌所产C14:0脂肪酸所占比例为32. 21%。再异源表达来自不动杆菌ADPl (Acinetobacter baylyi)中的高度非特异性高度非特异性的双功能蜡酯合成酶(WS)/酰基辅酶A 二酰甘油酰基转移酶，通过外源性流加乙醇的方式，催化脂肪酸代谢产物脂酰辅酶A与乙醇反应生成脂肪酸乙酯，即完成脂肪酸乙酯的生产新途径。具体为将不动杆菌中酰基转移酶基因atfA分别克隆至表达载体 pETDuet-chFatB/pETDuet-ucFatB/pETDuet-ccFatB 中得到重组质粒 pETDuet-chFatB-atfA/pETDuet-ucFatB-atfA/pETDuet-ccFatB-atfA。将重组质粒分别转入大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG诱导重组质粒表达，表达的硫酯酶特异性水解特定链长的脂酰ACP，分别得到C8:0-C10:0/C12:0/C14:0中链脂肪酸；这些中链脂肪酸会在胞内形成脂酰-CoA，共同表达的酰基转移酶利用外源性流加的乙醇(1% -5% )与中链脂酰-CoA发生酰基转移反应合成脂肪酸乙醇酯，得到利用重组大肠杆菌直接合成CS: 0-C10:0/C12:0/ C14:0中链脂肪酸乙醇酯的可再生资源工艺路线。本专利技术中硫酯酶特征在于通过特异性催化C8:0/C10:0/C12:0/C14:0脂酰ACP水解来提高大肠杆菌体内脂肪酸的含量；高度非特异性酰基转移酶的特性在于可催化脂酰 CoA与任意结构的醇类(包括乙醇)发生酰基转移反应生成脂肪酸乙醇酯。本专利技术首次克隆并表达来自萼距花属植物/月桂树/香樟中的特异性硫酯酶基因生产中链脂肪酸及其乙酯，可以有效改善生物柴油的低温性能，且发酵原料易得，可再生； 产物可直接分泌至胞外，产物提取工艺简单，大大降低成本，简化了生产工艺。附图说明图I :DNA琼脂糖凝胶电泳。左侧纯化后的萼距花属植物中硫酯酶基因PCR产物， 1248bp。右侧为DNA大小标准品。图2 :构建的重组载体pETDuet-chFatB的图谱，chFatB基因克隆于pETDuet-Ι载体，基因两端带有NdeI和EcoRV位点。图3 =DNA琼脂糖凝胶电泳。右侧纯化后的月桂树中硫酯酶基因PCR产物，1149bp。 左侧为DNA大小标准品。图4本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邓利，范丽苹，刘军锋，刘珞，王芳，谭天伟，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：
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