本发明专利技术公布了一种用于鲤鱼雌雄鉴别的方法，以斑马鱼BMP4基因序列为模版成功获得鲤鱼BMP4基因的cDNA序列，并在此基础上获得了鲤鱼BMP4基因的多克隆抗体，通过western技术检测发现：雄鱼可以检测到BMP4基因的表达，而雌鱼却无法检测到BMP4基因的表达，从而通过BMP4基因表达的检测可将鲤鱼雌雄鉴别开来，这也就为鲤鱼的早期雌雄鉴别提供了检测技术。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及。
技术介绍
目前，在鲤鱼生产和育种过程中，性别对鲤鱼的生长速度有明显的影响，一般而言，鲤鱼在IOg以后的各个阶段，雌鱼平均的生长速度均快于雄鱼，因此，如果在早起能够进行雌雄鉴别，养殖户将显著的提高经济效益，而对于鲤鱼育种，早期鉴别可进行鲤鱼的二次选择，也可大大节约育种成本。对雌雄鲤鱼特异性的分子标记，可用于鲤的分子育种中，先用特异性分子标记区分雌雄鱼，然后再进行设计育种，但是能够用蛋白检测的方法区分雌雄鲤鱼的研究还未见报道。GAPDH (甘油醛_3_磷酸脱氢酶)是参与糖酵解的一种关键酶，由4个30_40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作狗8切111 blot蛋白质标准化的内参。因为GAPDH作为看家基因在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，因此在使用GAPDH内参抗体时，将每个样品测得的目的蛋白含量与本样品的GAPDH含量相除，得到每个样品目的蛋白的相对含量，然后才进行样品与样品之间的比较。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供，该处理方法可以进行鲤鱼早起的性别鉴别。本专利技术为实现上述目的，采用如下技术方案1、，其特征在于按如下步骤实现 (1)提取雌雄鲤总RNA;(2 )获得鲤鱼Cyprinus carpio^W\基因cDNA序列根据斑马鱼BMP4基因序列 Genbank 登录号 AF4(^958 设计引物序列为上游引物F: 5，- gatacccgaggaagggaaga-3，； 下游引物R:5，- ggggtgtggctgccgctaaa _3，，获得鲤鱼的BMP4的cDNA，并根据上述 cDNA对应氨基酸序列设计多肽，合成多肽，并对多肽进行修饰获得鲤鱼BMP4多肽，其氨基酸序列为QVLLGESSYASLIPEEGKc，其中c为增加的cys，用于多肽偶联；(3)用鲤鱼BMP4多肽免疫新西兰大白兔，制备兔抗BMP4血清；(4)用BMP4多肽对兔血清进行抗原亲和纯化，纯化后获得鲤鱼BMP4多克隆抗体，抗体进行ELISA效价检测，结果显示，ELISA Titer大于1 128000 ；(5)用鲤鱼BMP4多克隆抗体western技术检测雌雄鲤鱼背部肌肉中BMP4基因的表达， 结果显示雄性鲤鱼有BMP4蛋白的表达，而在雌性鲤鱼中没有检测到BMP4蛋白的表达。具体来说首先获得高质量的鲤鱼BMP4抗体，其次，成功提取雌雄鲤鱼胸肌蛋白；然后用已检测的鲤鱼BMP4抗体对目标鲤鱼的胸肌蛋白进行检测，用GAPDH做目标蛋白的对照，如果能检测到55KD的蛋白，则为雄性鲤鱼，如果检测不到，则为雌性鲤鱼。有益效果我们在做BMP4在鲤鱼不同肌肉部位分布时发现雌雄鲤背部肌肉BMP4 蛋白表达水平差异显著，因此，我们认为可以从BMP4蛋白水平上区分鲤鱼的雌雄，可用于分子育种，也可用于雌雄鱼在BMP4相关路径上的区别以及由于BMP4蛋白表达水平的不同因此雌雄鱼其它生理功能上的差别。附图说明图1为通过本方法进行鲤鱼雌雄鉴别的结果，其中1为雌性鲤鱼胸肌， 2为雄性鲤鱼胸肌。具体实施例方式材料GAPDH蛋白抗体，鼠二抗，兔二抗购自吉尔生化(上海)有限公司； 下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。( 1)雌雄鲤(各5尾)取自中国水产科学研究院无锡淡水渔业研究中心宜兴养殖基地，取胸肌组织，液氮速冻后放置于-80° C冰箱冻存，以便于总RNA的提取。总RNA的提取按照RNAiso Plus操作说明书进行，提取完成后用DEPC水溶解。经琼脂糖凝胶电泳检测 RNA的提取情况，分光光度法检测RNA的浓度，然后用反转录试剂盒把RNA反转录成cDNA， 用于后续的PCR反应或-20° C保存，其余的RNA放于-80° C冰箱保存。(2 )获得鲤鱼QCyprinus carpi ο )ΒΜΡ4基因cDNA序列根据斑马鱼BMP4基因序列 (Genbank 登录号 AF402958)设计引物序列为上游引物F:5，_ gatacccgaggaagggaaga-3，； 下游弓丨物:R:5' - ggggtgtggctgccgctaaa _3，，获得鲤鱼的BMP4基因序列为CTGTCGAGACATCATGATTCCTGGTAATCGAATGCTGATGGTCATTTTATTATGCCAAGTCCTACTGGGAGA GAGCAGCTATGCTAGTCTAATACCCGAGGAAGGGAAGAAGAAAGCGTCGGCTCAGCACCTGGGTCAGAGTCATGAAC TGCTGCGGGACTTTGAAGCCACGCTGCTGCACATGTTTGGGCTGCAGAGGCGACCGCGACCCAGCTACTCGGCTGTG GTGCCCCAGTATCTGCTGGACCTGTATCGCCTGCAGTCAGGGGAGGCCGAAGAGGCCGGGGCCCACGACGTGAGCTT CGATTATCCCGAAAGGTCCACGAGTCGAGCAAACACTGTGAGAGGATTCCATCACGAAGAGCACATGGAAGAGCTGC AGTCAGACGGCTCACCGGAGACTCCTCTGCGCTTCGTCTTCAATCTCAGCAGCATCCCAGAGGAGGAACTCATTTCT ACTGCAGAGCTTCGTATCTACAGGCAACAGATAGATGATGCAATCTCAGATCCCCAACCCACGGGAGACGACGGTCT ACACCGAATAAACATATACGAGGTGCTGAAGCCCCCGCGGGCCGGGCAGCTCATCACGCAGCTGCTGGACACTCGAC TGGTGCGCCACAACACGACCCAATGGGAGAGCTTTGACGTGAGCTCAGCCGTACTGCGCTGGACCCGTGACAAGAGC TCCAATCACGGCCTGGCTGTGGAGGTGGTGCCCCTGAACCGAACCTCGCATCACCAGGGACGCCACGTACGCGTAAG TCGCTCCTTGCATCCGCTTCCAGATGCAGACTGGAGCCAGCTTCGCCCCCTGCTGGTCACGTTCGGGCATGACGGCA AAAGTCACCCACTGACGCGGCGAGCGAAACGCAGCCCGAAGCAAAGAGGTCGCAAGCGCAACCGAAACTGTCGGCGG CACGCGCTTTATGTGGACTTCAGCGACGTGGGCTGGAACGACTGGATCGTGGCGCCGCCCGGATATCAGGCGTACTA CTgTCACGGGAGTGTCCCTTTCCATTAGCCGATCATCTCAACTCCACCAATCACGCTATCGTACAGACACTGGTGAA CTCGGTGAACACCAATATCCCCAAAGCCTGCTGCGTGCCCACTGAGCTCAGCGCAATCTCCATGCTTTACCTGGACG AAACGGACAGGGTGGTGCTGAAAAACTATCAGGAGATGGTGGTCGAGGGGTGTGGCTGCCGCTAAA, 根据鲤鱼BMP4基因的氨基酸序列为M本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：苏胜彦，董在杰，袁新华，徐跑，朱文彬，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，
类型：发明
国别省市：
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