三元复合物和含有三元复合物的液体及制备方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种三元复合物，其特征在于，该三元复合物含有A组分，B组分和C组分，A组分为带有正电荷的载体，B组分为带有负电荷的核酸，C组分为带有负电荷的共聚物。本发明专利技术还提供了含有该三元复合物的液体及其制备方法。此外，还提供了上述三元复合物和含有三元复合物的液体的应用。本发明专利技术提供的三元复合物和含有三元复合物的液体能够兼具低毒和高转染效率。因此，能够广泛的用于细胞转染、疾病的预防、诊断和基因治疗中。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种三元复合物，一种含有三元复合物的液体，一种含有三元复合物的液体的制备方法以及三元复合物与含有三元复合物的液体的应用。
技术介绍
基因治疗在癌症治疗、病毒感染和心血管疾病的治疗上具有很好的应用前景，但基因治疗需要安全、有效的载体。合成的阳离子聚合物作为基因的非病毒载体得到了广泛的关注，如聚乙烯亚胺(PEI)、壳聚糖(CS)、聚赖氨酸(PLL)、聚β-氨基酯(Poly(i3-amino esters)，PBAEs)，聚酰胺-胺型树枝状聚合物(PAMAM)、聚二甲胺基丙烯酸乙酯(PDMAEMA) 等阳离子聚合物或含有这些阳离子聚合物链的共聚物，通过静电相互作用与带负电荷的 DNA或RNA复合形成纳米粒子。此外，还有表面带有正电荷的纳米金颗粒、纳米硅胶颗粒等也可作为DNA或RNA的载体。上述阳离子聚合物或纳米粒与DNA或RNA复合形成的纳米粒子可以促进基因的转染效果，但同时存在复合物表面正电性太强导致的毒性较大、体内运转时间短等问题。研究表明，在上述阳离子聚合物或纳米粒上引入聚乙二醇段可以大大提高生物相容性、降低纳米复合体系的毒性，延长纳米粒子在体内的循环时间等，但同时也导致纳米复合体系的细胞转染效率大大下降。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述缺陷，提供一种兼具低毒和高转染效率的三元复合物及其液体和制备方法及应用。本专利技术提供了一种三元复合物，其特征在于，该三元复合物含有A组分，B组分和 C组分，A组分为带有正电荷的载体，B组分为带有负电荷的核酸，C组分为带有负电荷的共聚物。本专利技术还提供了一种含有三元复合物的液体，其特征在于，该含有三元复合物的液体含有水和上述三元复合物。此外，本专利技术还提供了一种含有三元复合物的液体的制备方法，其特征在于，该方法包括使Y物质的水溶液与D物质的水溶液混合，并将所得的混合物与M物质的水溶液混合；其中，Y物质为载体，所述载体能够在水溶液中形成带有正电荷的基团；D物质为核酸；M 物质为能够在水溶液中形成带有负电荷基团的共聚物。以及提供了由上述方法制备得到的含有三元复合物的液体。本专利技术还提供了上述三元复合物或含有三元复合物的液体在细胞转染、疾病的预防、诊断和基因治疗中的应用。以及上述三元复合物或含有三元复合物的液体在制备细胞转染试剂，制备疾病的预防、诊断或基因治疗的药物中的应用。对本专利技术提供的三元复合物和含有三元复合物的液体进行细胞毒性实验，证实三元复合物的毒性远远低于二元复合物；对本专利技术提供的三元复合物和含有三元复合物的液体进行HeLa细胞转染实验，证实三元复合物相比二元复合物的细胞转染效率也有较大的提高。并且，对本专利技术优选实施方式制得的含有三元复合物的液体进行RNA干扰实验，证实由本专利技术的三元复合物和/或含有三元复合物的液体作为核酸的传递系统，能够高效地、 高特异性的使核酸进入靶细胞，并能够保证传递的核酸的干扰活性。由此可见，本专利技术提供的三元复合物和含有三元复合物的液体能够广泛的用于细胞转染、疾病的预防、诊断和基因治疗中，同时能够广泛的用于制备细胞转染试剂，制备疾病的预防、诊断或基因治疗的药物中。附图说明图1为本专利技术四种实施方式中的含有PCL-g-PDMAEMAl/D/M-Ι三元复合物的液体和六组对照组的凝胶电泳图。图2为本专利技术一种实施方式中PCL-g-PDMAEMAl/D/M-Ι三元复合物的透射电镜照片。图3为本专利技术两种实施方式中的含有PCL-g-PDMAEMAl/D/M-Ι三元复合物的液体和四组对照组的HeLa细胞转染效率的柱状图。图4为本专利技术四种实施方式中的含有PCL-g-PDMAEMAl/D/M-Ι三元复合物的液体和六组对照组的HeLa细胞毒性的柱状图。图5为本专利技术两种实施方式中的含有PCL-g-PDMAEMAl/siRNAl/M-2三元复合物的液体和对照组抑制HeLa-Luc细胞荧光素酶蛋白表达效率的柱状图。具体实施例方式本专利技术提供了一种三元复合物，其特征在于，该三元复合物含有A组分，B组分和 C组分，A组分为带有正电荷的载体，B组分为带有负电荷的核酸，C组分为带有负电荷的共聚物。根据本专利技术，所述共聚物可以为本领域各种带有负电荷的共聚物，只要能够与A 组分通过静电相互作用结合，形成所述的三元复合物即可，为了使形成的三元复合物具备更好的生物活性，优选地，C组分为聚谷氨酸与聚乙二醇形成的共聚物和/或聚谷氨酸与一个末端带有靶向性基团的聚乙二醇形成的共聚物根据本专利技术，所述带有正电荷的载体，即A组分优选为带有正电荷的纳米颗粒和/ 或带有正电荷的阳离子聚合物，进一步优选地，所述带有正电荷的纳米颗粒和带有正电荷的阳离子聚合物均含有基团Z，基团Z能够结合氢离子并形成带有正电荷的基团，并且基团 Z中的至少一部分与氢离子结合，形成了所述带有正电荷的基团，A组分带有的正电荷由所述带有正电荷的基团提供；B组分带有的负电荷由核酸中的磷酸二酯键失去至少部分氢离子后得到的基团提供，其中，磷酸二酯键为本领域公知的概念，即一种化学基团，指一分子磷酸与两分子醇(羟基)酯化形成的两个酯键，在水溶液中，至少部分磷酸上羟基的氢原子会解离，从而使核酸带有负电荷；优选情况下，C组分带有的负电荷由所述共聚物中的羧基失去至少部分氢离子后得到的基团提供，所述羧基为聚谷氨酸上没有用于聚合的羧基，在水溶液中，至少部分所述羧基能够电离，从而使C组分带有负电荷。需要明确的是，本专利技术中所述共聚物中羧基的摩尔数指呈电离状态的羧基的摩尔数与没有呈电离状态的羧基的摩尔数之和，即对应于共聚物中谷氨酸结构单元的摩尔数。根据本专利技术，所述基团Z的摩尔数(记为N)、核酸中的核苷酸的摩尔数(记为P) 与所述共聚物中羧基的摩尔数(记为C)的比例，简称为N/P/C值，可以在较大的范围内变化，为了获得更好的细胞转染效率并兼顾细胞相容性(即降低细胞毒性)，所述N/P/C值优选为1-50 1 1-50，进一步优选情况下，所述N/P/C值为1-30 1 1-30，并且，在优选条件下，所述A组分带有的正电荷、B组分带有的负电荷与C组分带有的负电荷使得三元复合物的kta电位为-20mV到30mV，进一步优选为-15mV到20mV。根据本专利技术，所述基团Z为任何可以实现能够结合氢离子并带有正电荷的基团， 如含有电负性较强的氮原子的氨基，具体地，本专利技术中所述基团Z优选为伯氨基、仲氨基和叔氨基中的一种或多种，进一步优选为叔氨基。此外，本专利技术中所述阳离子聚合物还包括目前商品化的各种阳离子聚合物型转染试剂，如阳离子脂质体和Transfectam试剂等，这里需要特别说明的是，本专利技术中，利用商购的阳离子脂质体和Transfectam试剂制备三元复合物的过程，所述阳离子脂质体和 Transfectam试剂均按照商购的试剂盒中的操作规程，根据所带有的N原子或正电荷的数目，得到满足一定N/P/C值的三元复合物。根据本专利技术，所述带有正电荷的纳米颗粒作为核酸的载体，优选颗粒直径为 10-400纳米；所述带有正电荷的纳米颗粒可以为本领域各种能够在溶液中形成带有正电荷基团的纳米颗粒，如通过各种方式形成的带有正电荷的金纳米颗粒和/或带有正电荷的硅胶纳米颗粒，当所述带有正电荷的纳米颗粒为金纳米颗粒和/或带有正电荷的硅胶纳米颗粒时，优选颗粒直径为10-200纳米，最本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种三元复合物，其特征在于，该三元复合物含有A组分，B组分和C组分，A组分为带有正电荷的载体，B组分为带有负电荷的核酸，C组分为带有负电荷的共聚物。2.根据权利要求1所述的三元复合物，其中，所述共聚物为聚谷氨酸与聚乙二醇形成的共聚物和/或聚谷氨酸与一个末端带有靶向性基团的聚乙二醇形成的共聚物。3.根据权利要求2所述的三元复合物，其中，A组分为带有正电荷的纳米颗粒和/或带有正电荷的阳离子聚合物。4.根据权利要求3所述的三元复合物，其中，所述带有正电荷的纳米颗粒和带有正电荷的阳离子聚合物均含有基团Z，基团Z能够结合氢离子并形成带有正电荷的基团，并且基团Z中的至少一部分与氢离子结合，形成了所述带有正电荷的基团，A组分带有的正电荷由所述带有正电荷的基团提供。5.根据权利要求1所述的三元复合物，其中，B组分带有的负电荷由核酸中的磷酸二酯键失去至少部分氢离子后得到的基团提供。6.根据权利要求2所述的三元复合物，其中，C组分带有的负电荷由所述共聚物中的羧基失去至少部分氢离子后得到的基团提供。7.根据权利要求4所述的三元复合物，其中，基团Z的摩尔数、核酸中的核苷酸的摩尔数与所述共聚物中羧基的摩尔数的比例为1-50 1 1-50，所述A组分带有的正电荷、B 组分带有的负电荷与C组分带有的负电荷使得三元复合物的kta电位为-20mV到30mV。8.根据权利要求7所述的三元复合物，其中，基团Z的摩尔数、核酸中的核苷酸的摩尔数与所述共聚物中羧基的摩尔数的比例为1-30 1 1-30，所述A组分带有的正电荷、B 组分带有的负电荷与C组分带有的负电荷使得三元复合物的kta电位为-15mV到20mV。9.根据权利要求4、7-8中任意一项所述的三元复合物，其中，基团Z为伯氨基、仲氨基和叔氨基中的一种或多种。10.根据权利要求3-4、7-8中任意一项所述的三元复合物，其中，所述带有正电荷的纳米颗粒的颗粒直径为10-400纳米，所述带有正电荷的纳米颗粒为带有正电荷的金纳米颗粒和/或带有正电荷的硅胶纳米颗粒。11.根据权利要求3所述的三元复合物，其中，所述阳离子聚合物的数均分子量为 lKDa-150KDa。12.根据权利要求3-4、7-8和11中任意一项所述的三元复合物，其中，所述阳离子聚合物选自聚乙烯亚胺、阳离子脂质体、聚β-氨基酯、壳聚糖、壳聚糖季铵盐、含有式(1)所示结构单元的聚合物、聚酰胺-胺型树枝状聚合物、两亲性梳形接枝共聚物和阳离子共聚物中的一种或多种，所述阳离子共聚物为聚乙烯亚胺、聚氨基酯、含有式(1)所示结构单元的聚合物、聚酰胺-胺型树枝状聚合物、两亲性梳形接枝共聚物中的至少两种形成的共聚物；13.根据权利要求12所述的三元复合物，其中，所述两亲性梳形接枝共聚物是在原子转移自由基聚合反应条件下，由含溴官能团的聚酯与至少一个末端为烯键的物质接触得到的，所述至少一个末端为烯键的物质为具有式(2)所示结构的单体、含有式(1)所示结构单元的聚合物和聚乙烯亚胺中的一种或多种，14.根据权利要求13所述的三元复合物，其中，所述含溴官能团的聚酯为 Y-(2-溴-甲基丙酸酯)_己内酯的均聚物、Y-(2-溴-甲基丙酸酯)-己内酯与内酯的共聚物和Y-(2-溴-甲基丙酸酯)-己内酯与交酯的共聚物中的一种或多种，其中，所述内酯为β-羟基丁酯、β-羟基戊酯和己内酯中的一种或多种，所述交酯为乙交酯和/或丙交酯。15.根据权利要求1所述的三元复合物，其中，所述B组分为核糖核酸。16.根据权利要求15所述的三元复合物，其中，所述B组分为双链核糖核酸。17.根据权利要求16所述的三元复合物，其中，所述B组分为带有1-10个核苷酸长度的单链区的双链核糖核酸。18.根据权利要求15-17中任意一项所述的三元复合物，其中，所述B组分为部分经过化学修饰的核糖核酸。19.根据权利要求18所述的三元复合物，其中，所述部分经过化学修饰的核糖核酸修饰的类型为核糖的修饰、碱基的修饰和磷酸二酯键的修饰中的至少一种。20.根据权利要求19所述的三元复合物，其中，所述部分经过化学修饰的核糖核酸所含有的修饰基团为氟代基团、硫代基团、烷氧基团、烷基基团、酰基基团和氨基基团中的至少一种。21.根据权利要求1、5、15-17、19-20中任意一项所述的三元复合物，其中，所述核酸为寡聚核苷酸和/或多聚核苷酸，所述核酸的分子量为1 X IO3-I X IO8022.根据权利要求2所述的三元复合物，其中，所述共聚物为AB型、ABA型和BAB型嵌段共聚物中的至少一种，且共聚物的数均分子量为1000-400000，其中，A为聚谷氨酸嵌段， 且A的数均分子量为500-300000，B为聚乙二醇嵌段和/或一个末端带有靶向性基团的聚乙二醇嵌段，且B的数均分子量为200-30000。23.根据权利要求2所述的三元复合物，其中，所述共聚物为含有聚谷氨酸主链和侧链的接枝共聚物，所述侧链为聚乙二醇和/或一个末端带有靶向性基团的聚乙二醇，所述接枝共聚物的数均分子量为1000-400000，接枝率为10-80%，聚谷氨酸主链的数均分子量为 500-300000,每个侧链的数均分子量为200-30000。24.根据权利要求2、22或23所述的三元复合物，其中，所述一个末端带有靶向性基团的聚乙二醇为一个末端被靶向性物质修饰了的聚乙二醇。25.根据权利要求M所述的三元复合物，其中，所述靶向性物质为叶酸、甘露糖、半乳糖、具有导向作用的短肽和适配子中的一种或多种。26.一种含有三元复合物的液体，其特征在于，该含有三元复合物的液体含有权利要求1-25中任意一项所述的三元复合物中的一种或多种和水。27.根据权利要求沈所述的含有三元复合物的液体，其中，所述含有三元复合物的液体中三元复合物的浓度为0. 001-4. 0克/升，所述含有三元复合物的液体中的三元复合物为颗粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：董岸杰，郭术涛，
申请(专利权)人：苏州瑞博生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：