用于移植的同种异体皮肤的处理方法及由其制备的冷冻保存同种异体皮肤技术

本发明专利技术涉及用于移植的同种异体皮肤的处理方法及由其制备的冷冻保存同种异体皮肤。更详细地，涉及以二甲基亚砜、动物细胞培养基及胎牛血清为基本成分，在其中添加蔗糖，从而制得冷冻保护剂，然后利用该溶液冷冻处理用于移植的皮肤组织的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于移植的同种异体皮肤的处理方法及由其制备的冷冻保存同种异体皮肤。更详细地，涉及以二甲基亚砜(dimethyl s ulfoxide)、动物细胞培养基及胎牛血清(fetal bovine serum)为基本成分，在其中添加蔗糖(sucrose)，从而制得冷冻保护剂， 然后利用该溶液冷冻处理用于移植的皮肤组织的方法。
技术介绍
皮肤是覆盖整个人体表面的最大器官，其防止体液的流失，以及防止有害物质和微生物由外部进入，抵御来自物理、化学方面的刺激等，执行保护我们身体的功能。对于因严重的烧伤、外伤、上皮癌切除及皮肤疾病等而使皮肤严重受损的患者，应起到阻止受损部位感染及体液损失的保护膜的作用，同时应使患者的伤口部位不留下疤痕，防止在自然愈合过程中可能发生的严重收缩。用于使受损的皮肤组织再生的方法有以下三种移植患者自身皮肤的自体移植(autograft)、移植他人皮肤的同种异体移植(allograft)及移植动物皮肤的异种移植(xenograft)。这些方法中自体移植最为理想，但烧伤部位范围大的情况下，能够确保组织的部位有限，在取皮部位还会留下新的伤口，因此存在困难。同种异体移植与其说起到永久移植的作用，不如说起到有助于伤口周围区域的细胞移动和愈合的作用。特别是在表皮层、真皮层及直至皮下层受损的3度烧伤的情况下，必须要进行皮肤移植治疗。现在主要采用的皮肤移植治疗方法为自体移植方法，由于在摘除了皮肤的健康部位产生新的外伤，因此增加了患者的痛苦，需要很长时间痊愈，并且经济负担也大。此夕卜，如严重的烧伤患者没有足够的身体健康部位的情况下，存在无法采用自体移植方法或需要进行多次移植手术的问题。试图通过采用他人皮肤的同种异体移植或采用猪等其它动物皮肤的异种移植等来解决上述问题，但这样不仅会发生免疫排斥反应，还会带来其它多种副作用。并且，国内外医院实施的烧伤手术最普遍的情况为先将坏死的表皮层和真皮层去除，然后利用捐赠者尸体的皮肤，去除表皮后，利用去除了真皮内细胞的无细胞真皮进行皮肤移植，以消除免疫排斥反应。之后培养的角质细胞在其上完成完整的皮肤。这样完成的皮肤含有基膜层，因此能够像实际皮肤一样起到保护我们身体的作用，防止外界有害物质的进入。但是这种用于移植的皮肤价格非常昂贵，并且大部分为进口产品，存在供需不畅的问题。另外，目前广泛采用的用于处理从捐赠者身上摘取的皮肤的方法为对皮肤用不同浓度的甘油进行处理的甘油保存法，但该方法使细胞失去生命力而使得细胞存活率低，导致治疗时间长
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题因此，本专利技术的目的在于提供一种新的用于移植的同种异体皮肤的处理方法，并以此作为技术课题，该方法在对用于移植的皮肤进行加工时，与现有的甘油保存法相比，能够更加有效地提高细胞的存活率，使生物学性质的变化最小化。解决技术问题的技术手段为了实现上述目的，本专利技术提供用于移植的同种异体皮肤的处理方法，其包括下列步骤i)混合胎牛血清(fetal bovine serum)、动物细胞培养基及二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide)；ii)在上述溶液中溶解蔗糖(sucrose)，从而制得冷冻保护剂；iii)将上述冷冻保护剂浸透于分离的皮肤中；iv)将浸透了冷冻保护剂的皮肤在程序冷冻仪(controlled rate f reezer)中冷冻。本专利技术还提供由上述处理方法制得的冷冻保存同种异体皮肤。下面详细说明本专利技术。本专利技术的冷冻保护剂中使用的基本成分为二甲基亚砜、动物细胞培养基及胎牛血清。以重量为基准，本专利技术使用的二甲基亚砜、动物细胞培养基及胎牛血清优选的混合比为 1 3 5 4 6。本专利技术中，动物细胞培养基的混合比小于3时，会因为必需营养物质的缺乏而产生细胞死亡率增加的问题，如果大于5，冷冻时，由于发生冷害，会存在细胞死亡率增加的问题。本专利技术中，胎牛血清的混合比小于4时，由于防冷害血浆蛋白的缺乏，会发生冷冻时因冷害引起的问题，如果大于6，会因为血浆成分过多，会产生细胞活性方面的问题。以重量为基准，本专利技术使用的二甲基亚砜、动物细胞培养基及胎牛血清最优选的混合比为1 4 5。本专利技术的动物细胞培养基可以使用本领域公知的任意的培养基。本专利技术中可以使用的动物细胞培养基例如有MEM、DMEM、RPMI 1640、IMDM、特定角化细胞-无血清培养基(Defined Keratinocyte-SFM)(不含 ΒΡΕ)、角化细胞(Keratinocyte)-SFN (含 ΒΡΕ)、 敲除(KnockOut)D-MEM、AmnioMAX-II完全培养基、AmnioMAX-ClOO完全培养基等，但并不限于这些。本专利技术的冷冻保护剂是在上述混合有基本成分的溶液中溶解蔗糖(sucrose)而制得的。在本专利技术的冷冻保护剂中加入蔗糖，保护其免受冷冻细胞膜和细胞膜蛋白质时出现的冰晶的影响并使其稳定的作用。因此，根据本专利技术的处理方法制得的冷冻保存同种异体皮肤的细胞存活率能够得以提高，采用蔗糖、胎牛血清及二甲基亚砜的理想混合比，能够使细胞存活率得到更大的提高。本专利技术中的蔗糖优选为在上述混合有基本成分的溶液中以最终浓度为25 40重量％进行溶解。如果本专利技术的冷冻保护剂中的蔗糖浓度小于25重量％，会降低提高细胞存活率所需的细胞膜和膜蛋白质的保护及稳定等作用，如果大于40 重量％，会由于高浓度的糖(sugar)成分，诱发细胞死亡率的增加。本专利技术的冷冻保护剂最优选为使蔗糖在上述混合有基本成分的溶液中以最终浓度为30重量％进行溶解。本专利技术中，在皮肤组织中浸透冷冻保护剂可以使用本领域公知的多种方法，优选在低温反应器中，使冷冻保护剂浸透皮肤。浸透所需的时间根据皮肤组织的大小等有所不同，例如在4°C的低温反应器中，可以浸透约6 M小时。本专利技术中浸透了冷冻保护剂的皮肤可以使用程序冷冻仪(control led rate4freezer)进行冷冻。冷冻时使用程序冷冻仪能够以期望的速度冷冻皮肤。本专利技术中使用程序冷冻仪冷冻皮肤的速度优选为-0. I0C /min至-7V /min，最优选为_1°C /min。本专利技术进行冷冻时，由于浸透了冷冻保护剂的皮肤的温度和程序冷冻仪腔室(chamber)的温度不能够相同，因此在冷冻时，由于从发生潜在熔化热的区域急速冷冻至没有水分子运动的-80°C 温度，其速度每分钟超过10°C，因此若不能够调节潜在熔化热，则会发生冰晶现象，使组织破坏。专利技术的效果根据本专利技术的处理方法制备的冷冻保存同种异体皮肤的细胞存活率高，细胞的生物学性质的变化也小，从而有助于移植部位快速生成肉芽组织，可以提高无细胞真皮的移植率并缩短治疗周期。附图说明图1为示出使用TUNEL分析法对甘油保存皮肤(GPA)及冷冻保存皮肤(CPA)进行细胞死亡率分析的图表。图2为将甘油保存皮肤进行H&E染色后，用光学显微镜放大200倍后拍摄的照片， 图3为将冷冻保存皮肤进行H&E染色后，用光学显微镜放大200倍后拍摄的照片。图4为将甘油保存皮肤进行TUNEL染色后，用荧光显微镜放大100倍后拍摄的照片，图5为将冷冻保存皮肤进行TUNEL染色后，用荧光显微镜放大100倍后拍摄的照片。图6为示出使用TUNEL分析法，对细胞死亡率随蔗糖浓度差异的变化进行分析的图本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.07.22 KR 10-2009-00669251.用于移植的同种异体皮肤的处理方法，其包括下列步骤i)混合二甲基亚砜、动物细胞培养基及胎牛血清； )在上述溶液中溶解蔗糖，从而制得冷冻保护剂；iii)将上述冷冻保护剂浸透于分离的皮肤中；iv)将浸透了冷冻保护剂的皮肤在程序冷冻仪中冷冻。2.根据权利要求1所述的用于移植的同种异体皮肤的处理方法，其特征在于，使蔗糖在上述步骤i)的溶液中以最终浓度为25 40重量％进行溶解。3.根据权利要求2所述的用于移植的同种异体皮肤的处理方法，其特征在于，蔗糖的最终浓度为30重量％。4.根据权利要求1所述的用于移...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔源益，田旭，郑载得，
申请(专利权)人：CG生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：