提高维生素K依赖性蛋白质的表达产量的方法技术

本发明专利技术包括一种或多种选自i)维生素K的还原形式和/或ii)维生素K类似物的还原形式和/或iii)维生素K前体的还原形式的化合物用于在细胞培养物中表达一种或多种功能性维生素K依赖性蛋白质的用途以及用于发酵表达一种或多种维生素K依赖性蛋白质的真核细胞的方法，其中在发酵方法之前和/或期间，将一种或多种选自i)维生素K的还原形式和/或ii)维生素K类似物的还原形式和/或iii)维生素K前体的还原形式的化合物加入细胞培养基。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】提高维生素K依赖性蛋白质的表达产量的方法维生素K参与蛋白质中某些谷氨酸残基的羧化以形成Y-羧基谷氨酸残基 (Gla-残基)。经修饰的残基位于称为Gla结构域的特定蛋白质结构域内。Gla-残基通常参与钙结合。Gla-残基是所有已知Gla-蛋白的生物活性所必需的。在过去30年已阐明了如何将维生素K用于把Glu转化成Gla的生物化学法。在细胞内，维生素K通过维生素K环氧化物还原酶(VKOR)被电子还原成维生素K的还原形式 (称为维生素K氢醌)。编码VKOR的基因(VKORCl)最近已被鉴定，并且详细地描述于Rost 等人，2004(Q004)Nature，427，537-541))中。随后另一种酶氧化维生素K氢醌以使Glu 羧化成Gla;该酶称为Y-谷氨酰羧化酶或维生素K依赖性羧化酶(VKGC)。只有这种羧化酶能够同时将维生素K氢醌氧化成维生素K环氧化物时，羧化反应才进行；羧化和环氧化反应据认为是偶联反应。维生素K环氧化物随后被维生素K环氧化物还原酶再转变成维生素K。这两种酶包含所谓的维生素K循环(维生素K)。http //en. wikipedia. org/wiki/ Vitamin K—cite note-Stafford_28#cite note-Stafford-28。目前，已在一级结构水平上表征了下列人含Gla蛋白质凝血因子11(凝血酶原)、VII、IX、X、抗凝蛋白C和S及因子X靶向蛋白Z，以及骨Gla-蛋白质骨钙素、抑制钙化的基质Gla蛋白(MGP)、调节细胞生长的生长抑制特异性基因6蛋白(Gas6)以及功能仍然未知的4种跨膜Gla蛋白(TMGP)。可用作激活Axl受体酪氨酸激酶和刺激细胞增殖或阻止某些细胞的细胞凋亡的生长因子。在其功能已知的所有情况下，此类蛋白质中的 Gla残基的存在显示是功能活性所必需的。多个Gla残基允许Gla-结构域经历构象变化， 所述构象变化是维生素K依赖性蛋白的活性以及对磷脂膜表面的结合所必需的。维生素K依赖性凝血蛋白质需要完全或几乎完全羧化来在钙离子存在的情况下结合膜表面。如果维生素K拮抗剂抑制Y羧化，那么羧化不全的维生素K依赖性蛋白不能形成钙依赖性结构，这导致对磷脂膜的低亲和力和较低的活性。B型血友病患者中发现的羧化不全因子IX突变体的前凝血剂活性丧失可归因于受损的钙诱导构象变化和结合磷脂小囊泡的能力的丧失。生物技术已提供了产生低成本生物药剂产品的希望。关于凝血因子，这提供了为更广泛的血友病患者提供充分治疗的机会。不幸地，该希望主要因天然存在的生物分子的固有复杂性和多种与它们的重组蛋白质对应物在基因工程改造的细胞中的合成相关的限制而未得到满足。本申请针对的是对产生维生素K依赖性蛋白例如因子IX或因子IX或因子VII/ VIIa的方法的需要，所述蛋白已被适当加工以便它们具有活性并且对于商业生产来说具有足够的产率。为了增加维生素K依赖性凝血蛋白的可用度(以满足对出血障碍例如B型血友病的治疗的世界范围内医学需要)，提高完全功能性蛋白质的产量，在本实例中需要来自基因工程改造的细胞的因子IX。具体地，需要鉴定和补充获得基本上完全的翻译后修饰所需要的酶促活性的缺乏。因此，存在对在宿主生物中增加维生素K依赖性蛋白的表达，特别是重组表达，从而导致表达的维生素K依赖性蛋白的分泌速率和/或活性提高的强烈需求。在人因子IX的情况下，Y -羧化蛋白质的重组过表达显示对更高的分泌率下前肽切割和Y -羧化的限制，从而当维生素K在培养基中可过量获得时，也产生只被Gla残基部分占据的蛋白质。这导致分泌活性减小的维生素K依赖性重组蛋白变体。维生素K向培养基的加入在高表达水平上不增加因子IX活性。已显示为了引发活性因子IX而需要存在于细胞培养基中的维生素K达到5 μ g/ml的饱和度。低于该水平，活性因子IX从中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的分泌量依赖于维生素K浓度(Kaufman, R.J.等人(1986)，J. Biol. Chem.， 261,9622-9628)。维生素K和维生素K类似物构成一组具有共同的2-甲基-1，4-萘醌结构(称为甲萘醌)的亲脂性、疏水性维生素。维生素的维生素K族的所有成员共有甲基化的萘醌环结构，并且在于3位置连接的脂肪族侧链中变化。植物和蓝细菌(cyanobacteria)(几乎不变地)只合成一种称为叶绿醌 (phylloquinone)(也称为维生素K1)的化学形式，其具有与叶绿素中相同的植基(phytyl) 侧链。通常由肠中细菌产生的甲基萘醌类(也称为维生素K2)与叶绿醌的差异在于3-侧链通常包含重复异戊二烯基单元的聚合物而非植基链。为了命名，按照异戊二烯基单元的数目分类甲基萘醌类，该数目以后缀给出(即缩写为Mk-n的甲基萘醌-η)，一些异戊二烯基单元也可被饱和，如由前缀二氢、四氢等所标示的，并且缩写为Mk-N (H2)、Mk-N (H4)等。普遍公认萘醌是官能团，其作用机制对于所有维生素K类是相似的。在无细胞系统中还显示甲萘醌和还原型甲萘醌在促进Y羧化中无活性 (Sadowski 等人(1976)，J. Biol. Chem.第 251 卷，No. 9pp. 2770-2776)。除了将维生素K补充到细胞培养基中外，还已尝试增加功能性维生素K的表达的其他方法。维生素K依赖性γ -羧化酶(VKGC)的过表达在因子IX的情况下未导致蛋白质分泌增力口 (Rehemtulla, Α.等人(1993) PNAS 90,4611-4615)。最近一些研究小组显示，VKGC和VKOR的共表达可增加功能性维生素K依赖性蛋白的表达水平(W0 2005/030039、WO 2005/040367、W02006/089613、WO 2006/101474、WO 2007/065173 和 WO 2007/075976)。专利技术概述本专利技术的专利技术者已令人惊讶地发现，通过用选自i)维生素K的还原形式和/或 ii)维生素K类似物的还原形式和/或iii)维生素K前体的还原形式之中的一种或多种化合物补充维生素K依赖性蛋白的细胞培养基，相应的活性维生素K依赖性蛋白的表达产率与当将相同量的所述各维生素K和/或维生素K其类似物和/或维生素K前体(但非其还原形式)加入细胞培养基时获得的表达产率相比较而言获得显著增加。本专利技术的一个实施方案是维生素K的还原形式和/或维生素K类似物的还原形式用于增加哺乳动物细胞中功能性维生素K依赖性蛋白的表达产率的用途。本专利技术的一个实施方案涉及产生重组生物活性维生素K依赖性蛋白产物的方法， 该方法包括在细胞培养基(所述培养基在表达期过程中至少在一些时间点包含维生素K的还原形式和/或维生素K类似物的还原形式和/或维生素K前体的还原形式)中使用具有5与表达所述生物活性维生素K依赖性蛋白的启动子有效连接的编码维生素K依赖性蛋白的至少一个基因的哺乳动物细胞，和收获所述维生素K依赖性蛋白产物。任选地，哺乳动物细胞系此外还包含与至少一个启动子有效连接的编码加工因子(processing factor)的基因。在优选实施方案中，维生素K依赖性蛋白产物为因子II、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C或蛋白S。更优选地，维生素K依赖性蛋白为因子IX或因子VII。在优选实施方案中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·金纳，A·斯陶尔斯，P·休珀麦斯，F·古德温，
申请(专利权)人：CSL有限公司，
类型：发明
国别省市：