一种基于原子力显微术的单克隆抗体靶向药疗效检测方法技术

本发明专利技术公开一种基于原子力显微术的单克隆抗体靶向药疗效检测方法，可在单细胞单分子水平有效测量单克隆抗体药物分子与靶点分子之间的结合力以及靶细胞表面靶点分子的分布密度，用于判断单克隆抗体药物分子的疗效，从而为新药研发和疾病治疗提供决策。具体方法为通过将单克隆抗体药物分子连接到AFM探针针尖表面，在单个细胞上测量单克隆抗体药物分子与分布于细胞表面的靶点分子之间的结合力以及靶点分子的分布密度，实现生理环境下单个细胞表面分布的靶点分子与单克隆抗体药物分子之间的结合力以及靶点分子分布密度的测量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于纳米技术与新药研发相结合的交叉科学
，具体涉及。
技术介绍
1997年批准上市的利妥昔单克隆抗体(rituximab)为肿瘤的治疗带来了革命性的变化，开启了肿瘤靶向治疗的新时代。传统的化疗药物在杀死肿瘤细胞的同时也杀死正常细胞，而靶向药则具有高度的选择性，通过特异性地结合肿瘤细胞的作用靶点来杀死肿瘤细胞，因而能显著降低对正常细胞的毒副作用。近年来分子靶向治疗在临床应用中取得突破性进展，与传统化疗结合可大幅度提高患者的缓解率和存活率，已成为恶性肿瘤的主流治疗方案，同时靶向药物的研发成为新药研发的热点。然而在肿瘤的临床靶向治疗中发现，不同亚型的肿瘤呈现出明显的疗效差异。如利妥昔单抗对惰性淋巴瘤的疗效可达50%， 而对侵袭性淋巴瘤的疗效则不到10%。为了提高靶向药物的疗效，就需要在单细胞单分子水平对生理环境下靶向药的作用机理开展研究，阐明药物分子与靶点分子之间的作用本质，以揭示造成疗效差异的分子机制。目前有关细胞内生命活动化学过程的认识，都是通过在试管中进行的集群平均试验获得的。集群平均试验反应了来自许多细胞的大量分子活动的平均结果。集群平均的结果无疑是正确的，它为人们带来了有关细胞生理活动化学过程的丰富资料，是人们认识细胞活动的重要基础，但集群平均同时也掩盖了单个分子的活动状态，单个分子的个性与不同被淹没于整体之中。为了提高靶向药物的疗效，就迫切需要开展单分子水平的实验以深入揭示生命活动中单个分子的活动状态。原子力显微术(atomic force microscopy,AFM) 的专利技术为阐明靶向药物分子的作用机制提供了新的技术手段。AFM不仅具有纳米级的分辨率，而且能在生理环境下工作，可在单细胞单分子水平对自然状态下的蛋白质分子进行研究。如果能够挖掘AFM应用于新药研发药效检测的潜力，则新药研发的成功率将显著提高， 新药研发的成本将明显降低，新药研发的周期将大大缩短，对国民经济和国家安全意义重大。但目前还没有这方面的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于AFM的单克隆抗体靶向药疗效检测方法，可在单细胞单分子水平有效测量生理环境下单克隆抗体药物分子与靶点分子之间的结合力以及靶细胞表面靶点分子的分布密度，用于判断单克隆抗体药物分子的疗效，从而为新药研发和疾病治疗提供决策。具体方法为通过将单克隆抗体药物分子连接到AFM探针针尖表面，在单个细胞上测量单克隆抗体药物分子与靶点分子之间的结合力以及靶点分子在细胞表面的分布密度，实现生理环境下单个细胞表面分布的靶点分子与单克隆抗体药物分子之间的结合力以及靶点分子分布密度的测量。其步骤包括(1)利用化学修饰方法将单克隆抗体药物分子连接到AFM针尖表面；(2)利用光学显微镜系统将修饰了单克隆抗体药物分子的AFM针尖定位到细胞表(3)控制探针逐步逼近细胞表面并接触细胞以使AFM针尖上的单克隆抗体药物分子与细胞表面的靶点分子发生结合反应，然后使探针从细胞表面回退，记录逼近-回退过程中AFM探针悬臂偏转量随针尖-细胞表面之间距离的变化关系，即得到力-距离曲线(简称力曲线)；(4)分析力曲线，计算得到单克隆抗体药物分子与靶点分子之间的结合力；(5)在抬高模式下利用修饰有单克隆抗体药物分子的探针对细胞表面的局部区域进行扫描，得到反应细胞表面靶点分子分布情况的三维相位AFM图像；(6)根据细胞表面靶点分子与单克隆抗体药物分子之间的结合力以及靶点分子分布密度，判断单克隆抗体药物分子的疗效。所述化学修饰方法将单克隆抗体药物分子连接到AFM针尖表面的具体步骤为首先利用3-氨丙基三乙氧基硅烷((3-aminopropyl) triethoxysilane, APTES) 和二异丙基乙胺(NN-diisopropylethylamine)将AFM针尖表面覆盖一层氨基(NH2)，氨基 (NH2)可与聚乙二酉享连接分子((N-hydroxy-succinimide) -polyethyIeneglycol-Maleimid e，NHS-PEG-MAL)的NHS端相结合形成稳定的氨基化合物，从而将连接分子连接到AFM针尖上；利用N-琥珀酰亚胺-3-乙酰硫代丙酸酯(N-succimidyl 3- (acetylthio) -propionate, SATP)将硫氢基(SH)修饰到单克隆抗体药物分子，SH基可与连接分子的MAL端相结合形成稳定化合物，从而将单克隆抗体药物分子通过连接分子NHS-PEG-MAL修饰到AFM针尖。所述在抬高模式下利用修饰有单克隆抗体药物分子的探针对细胞表面的局部区域进行扫描的步骤为AFM首先进行主扫描，以获取细胞的表面形貌信息，然后抬高探针进行抬高扫描，以获取细胞表面靶点分子分布信息。本专利技术针对现有集群平均方法的不足，根据靶向药物分子的作用特点，提出一种基于AFM的单克隆抗体靶向药疗效检测方法。本专利技术的技术效果体现在1.本专利技术利用化学修饰方法将单克隆抗体药物分子连接到AFM针尖上，实现单个细胞表面分布的靶点分子与单克隆抗体药物分子之间的结合力以及靶点分子分布密度的测量；2.本专利技术在生理环境下测量活细胞上自然状态的靶点分子与单克隆抗体药物分子的结合力以及靶点分子的分布密度，具有重要的实用意义。附图说明图1是本方法原理图；图2是本方法检测⑶20与其抗体rituximab之间结合力的原理图；图3是将rituximab连接到AFM针尖的化学修饰过程图；图4是利用AFM光学显微镜系统将探针定位到细胞图；图5是淋巴瘤细胞AFM成像图；图6是测量药物分子-靶点分子之间结合力原理图；图7是利用修饰有rituximab的探针实际获取的一条力曲线图；图8是利用修饰有rituximab的探针获取的典型回退曲线图；图9是对获取的力曲线进行统计分析图；图10是抬高扫描原理图；图11是利用抬高扫描测量淋巴瘤细胞表面CD20分布密度图。具体实施方式下面结合附图以抗CD20单克隆抗体rituximab为例对本专利技术作进一步详细的说明如图1所示，通过将AFM进行探针功能化，在单个细胞上测量药物分子与靶点分子之间的结合力以及靶点分子在细胞表面的分布密度，从而在单细胞单分子水平检测靶向药的疗效，为下一代药物研发和重大疾病的治疗提供关键技术。(1)CD20蛋白质分子为淋巴瘤治疗的一个靶点，广泛分布于淋巴瘤细胞的表面。rituximab是抗⑶20单克隆抗体，通过与淋巴瘤细胞表面的⑶20分子结合杀死靶细胞。如图2所示，通过聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)连接分子N羟基琥珀酰亚月安一IZi二酉享-^JfeIjtMK ((N-hydroxy-succinimide) -polyethyleneglycol-Maleimid e, NHS-PEG-MAL)(购自北京键凯科技有限公司)将rituximab (军事医学科学院附属医院提供)连接到AFM的探针针尖上(AFM及探针购自美国维易科公司，AFM型号为Dimension 3100，探针型号为DNP-S)，将淋巴瘤细胞生长在基底上，在单个淋巴瘤细胞上测量细胞表面的⑶20与AFM针尖上修饰的rituximab之间的结合力以及⑶20在淋巴瘤细胞表面的分布也/又。(2)利用化学修饰将rituximab连接到AFM针尖上，如本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于原子力显微术的单克隆抗体靶向药疗效检测方法，其特征在于通过将单克隆抗体药物分子连接到AFM探针针尖表面，在单个细胞上测量单克隆抗体药物分子与靶点分子之间的结合力以及靶点分子在细胞表面的分布密度，实现生理环境下单个细胞表面分布的靶点分子与单克隆抗体药物分子之间的结合力以及靶点分子分布密度的测量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于包括以下步骤(1)利用化学修饰方法将单克隆抗体药物分子连接到AFM针尖表面；(2)利用光学显微镜系统将修饰了单克隆抗体药物分子的AFM针尖定位到细胞表面；(3)控制探针逐步逼近细胞表面并接触细胞以使AFM针尖上的单克隆抗体药物分子与细胞表面的靶点分子发生结合反应，然后使探针从细胞表面回退，记录逼近-回退过程中 AFM探针悬臂偏转量随针尖-细胞表面之间距离的变化关系，即得到力-距离曲线(简称力曲线)；(4)分析力曲线，计算得到单克隆抗体药物分子与靶点分子之间的结合力；(5)在抬高模式下利用修饰有单克隆抗体药物分子的探针对细胞表面的局部区域进行扫描，得到反应细胞表面靶点分子分布情况的三维相位AFM图像；(6)根据细胞表面靶点分子与单克隆抗体药物分子之间的结合力以及靶点分子分布密度，判断单克隆抗体药物分子的疗效。3.根据权利要求2所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘连庆，李密，席宁，王超越，董再励，肖秀斌，张伟京，
申请(专利权)人：中国科学院沈阳自动化研究所，
类型：发明
国别省市：