本发明专利技术公开了一种胰岛素A链HLA-A*0201限制性CTL表位改造肽配体（APL），是将人源化NOD小鼠的胰岛素A链HLA-A*0201限制性天然CTL表位mInsA2-10中的第6位氨基酸L-Cys替换为D-Cys而得，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示；由于该天然CTL表位与人类表位存在高度的交叉反应性，而该APL在人源化NOD小鼠体外细胞免疫功能实验中具有显著抑制天然表位特异性CTL应答的特性，且肽本身具有易于规模性制备和纯化、使用安全等特点，因此，本发明专利技术的APL可单独或联合其他免疫显性自身抗原表位或APL应用于I型糖尿病治疗性负调肽疫苗的研制，在人类I型糖尿病治疗领域具有潜在、良好的开发应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，涉及一种抗原表位改造肽配体(altered peptide ligand, APL)，特别涉及胰岛素A链(n^nsA)的HLA_A*0201限制性CTL表位APL。
技术介绍
I型糖尿病(Type 1 diabetes，TlD)是T淋巴细胞介导的以清除生成胰岛素的β 细胞为特点的一类自身免疫性疾病，多发于儿童及青少年。同时，由于高血糖可能进一步引发眼、血液、心血管和神经系统疾病，预防和控制胰腺组织破坏等病理性自身免疫反应症状也非常重要。目前，TlD主要以外源胰岛素替代为主要治疗手段，费用高昂且副作用大，因此，急需寻找一种能够有效下调自身免疫状态的干预性治疗策略。近年来，对于TlD的免疫治疗策略主要包括以下几类化学药物(如环孢素Α、雷帕霉素、细胞因子或细胞因子受体)治疗；抗体(如CD3单抗、CD20单抗、抗淋巴细胞球蛋白抗体)介导的治疗；小分子蛋白抑制剂(如酪氨酸激酶抑制剂)治疗；抗原特异性耐受策略(如天然肽诱导耐受、APL诱导耐受、抗原肽偶联ECDI固定的抗原递呈细胞诱导耐受、负载抗原肽的纳米微粒诱导耐受)。其中，化学药物及抗体等介导的广泛非特异性免疫耐受虽然在一些动物及临床试验中取得了较好的结果，但同时也带来了更大的致病风险。动物实验证实给予非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠口服或接种自身抗原，可减缓甚至完全阻断TlD的发生、发展，其免疫耐受重建的机制主要包括克隆缺失、克隆无能、主动抑制及旁观者抑制等。相对于结构复杂的大分子天然抗原，小分子表位肽具有更易诱导免疫耐受、相对安全、易于实现规模制备和纯化等优点，最重要的是可以通过一些氨基酸位点的化学修饰最大限度地增强其免疫调节的能力。近年来，在NOD小鼠模型研究中有愈来愈多的证据表明自身反应性CD8+ T细胞(即细胞毒T淋巴细胞，CTL)在糖尿病致病机制中具有十分重要的作用。单独将从发生TlD的 NOD小鼠胰岛中新鲜分离出的CD4+ T细胞过继性转移给NOD scid小鼠，并不能诱导TlD的发生；但单独输注发生TlD的NOD小鼠胰岛浸润⑶8+ T细胞，却能在剔除⑶4+ T细胞的NOD 或NOD scid小鼠中很快诱发T1D，而剔除⑶8+ T细胞或敲除⑶8 α的NOD小鼠同样表现为 TlD抵抗。此外，研究报道，TlD的发生与HLA-A*0201分子密切相关。因此，近年来陆续鉴定了系列人和小鼠TlD自身抗原HLA-A*0201限制性CTL表位，其中部分存在较高的人、鼠交叉反应性。利用这些CTL表位肽在NOD小鼠体内有效地诱导特异性CTL免疫耐受，对TlD 具有一定的防治作用。在HLA-A*0201 转基因 NOD 小鼠中， TlD的发病时间较普通NOD小鼠提前，且程度加重，是良好的人源化NOD小鼠。在人源化NOD 小鼠中，mInsA2_10已被证实为HLA_A*0201限制性优势CTL表位，且与人源抗原序列具有同源性。因此，通过改造HiInsA2,来获得对自身反应性CTL具有负调节效应的APL，对TlD的防治研究具有重要意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于对人源化NOD小鼠的HLA_A*0201限制性优势 CTL 表位 n^nsA2_1(l (氨基酸序列为 Ile-Val-Asp-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile)进行改造，从而获得对自身反应性CTL具有负调节效应的APL ；目的之二在于提供所述APL在制药领域中的应用。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案1. mlnsA 的 HLA_A*0201 限制性 CTL 表位 APL，氨基酸序列如 Ile-Val-Asp-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile所示，其中第6位Cys为D型氨基酸。也就是说，该APL是将mInsA2_1(1中的第6位氨基酸Z-Cys替换为々-Cys而得。2.所述mlnsA的HLA_A*0201限制性CTL表位APL在制备TlD治疗性负调肽疫苗中的应用。本专利技术的有益效果在于本专利技术公开的人源化NOD小鼠的HLA-A*0201限制性天然 CTL表位HiInsA2,与人类表位之间存在高度的交叉反应性，而本专利技术的APL在人源化NOD小鼠体外细胞免疫功能实验中具有显著抑制天然表位特异性CTL应答的特性，且肽本身具有易于规模性制备和纯化、使用安全等特点，因此，本专利技术的APL可单独或联合其他免疫显性自身抗原表位肽或APL应用于TlD治疗性负调肽疫苗的研制，在人类TlD治疗领域具有潜在、良好的开发应用前景。附图说明图1为APL与HLA_A*0201分子的相对亲和力检测。图2为ELISpot法检测APL对胰腺特异性T淋巴细胞IFN- γ分泌能力的影响，* 表示两组间比较有显著性差异(P < 0. 05)。图3为胞内因子染色法检测APL对表位特异性CTL IFN- γ分泌能力的影响。图4为CFSE染色法检测APL对表位特异性CTL增殖能力的影响。具体实施例方式为了使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。一、APL的设计与初步筛选采用软件hsightll对拟改造表位mInsA2_1(1与HLA_A*0201的复合物(pMHC)进行建模，得到PMHC的结构。将拟改造表位HiInsA2,进行单个或多个氨基酸位点的型氨基酸替换，得到一系列APL。分别计算mInSA2_1(1及各APL第1位与第9位Ca原子(C1-C9)的距离、各APL在分子动力学模拟过程中相对HiInsA2,初始坐标发生位置变化的均方根偏差 (RMSD )以及mInsA2_1(1及各APL与HLA_A*0201分子之间的H键数目。分析各APL与mInsA2_1(1 的匹配情况，初步筛选出C1-C9距离变化较小、RMSD相对较小、H键数目不变或增加的APL (见表1)进行进一步实验。表1 APL的初步筛选结果权利要求1.胰岛素A链HLA-A*0201限制性CTL表位改造肽配体，其特征在于，氨基酸序列如Il e-Val-Asp-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile 所示，其中第 6 位 Cys 为 D 型氨基酸。2.权利要求1所述的胰岛素A链HLA-A*0201限制性CTL表位改造肽配体在制备I型糖尿病治疗性负调肽疫苗中的应用。全文摘要本专利技术公开了一种胰岛素A链HLA-A*0201限制性CTL表位改造肽配体(APL)，是将人源化NOD小鼠的胰岛素A链HLA-A*0201限制性天然CTL表位mInsA2-10中的第6位氨基酸L-Cys替换为D-Cys而得，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示；由于该天然CTL表位与人类表位存在高度的交叉反应性，而该APL在人源化NOD小鼠体外细胞免疫功能实验中具有显著抑制天然表位特异性CTL应答的特性，且肽本身具有易于规模性制备和纯化、使用安全等特点，因此，本专利技术的APL可单独或联合其他免疫显性自身抗原表位或APL应用于I型糖尿病治疗性负调肽疫苗的研制，在人类I型糖尿病治疗领域具有潜在、良好的开发应用前景。文档编号A61P3/10GK102295684SQ20111025497公开日2011年12月28日 申请日期2011年8月31日 优先权日2011年8月31日专利技术者吴玉章, 牛微, 本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．胰岛素Ａ链ＨＬＡ－Ａ＊０２０１限制性ＣＴＬ表位改造肽配体，其特征在于，氨基酸序列如Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ａｓｐ－Ｇｌｎ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ所示，其中第６位Ｃｙｓ为Ｄ型氨基酸。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王莉，舒驰，陈晓玲，牛微，吴玉章，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学，
类型：发明
国别省市：85
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