本发明专利技术涉及一种与牙釉质表面轴向特异性结合的七肽序列及其应用。本发明专利技术应用噬菌体表面展示技术，筛选出一种能与牙釉质表面轴向特异性结合的七肽，其氨基酸序列如下：Asn-Asn-His-Tyr-Leu-Pro-Arg。该七肽具有与与牙釉质表面轴向特异性结合的特性，并且能够促进脱矿牙釉质表面的再矿化过程。该发明专利技术提供的七肽对龋病的诊断以及龋坏牙体再矿化修复具有很高的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及利用噬菌体表面展示技术，筛选出能与牙釉质表面轴向特异性结合的多肽，具体地说，是应用随机七肽噬菌体展示文库筛选与牙釉质表面轴向特异性结合的噬菌体，得到能促进脱矿牙釉质表面再矿化的七肽序列。
技术介绍
龋病是人类最常见口腔疾病之一，其进展最终会导致牙体硬组织缺损并严重影响人们的日常生活。牙齿暴露于口腔中的唾液中，正常人体牙齿处于脱矿与再矿化的动态矿化平衡之中，二者相互依存，相互拮抗。当促进脱矿的因素加重时，即以脱矿为主，牙体中的羟基磷灰石开始溶解。从病因学以及病理学的角度出发，龋病可以理解为致病细菌(变性链球菌等)酸性代谢产物干扰下，牙体矿物质脱矿与再矿化的失衡(以脱矿为主)。近年，随着保存齿科学的兴起，人们针对龋病的策略开始强调龋病早期诊断和再矿化治疗(龋病早期治疗)。这样可以最大程度的减少牙体组织的缺损。众所周知，有机物在矿物的形成中起着生物调控作用，该过程称为生物矿化。牙体硬组织的生物形成就是生物矿化的一个典型例子。有机物对矿物的调控具体表现为对矿物晶体的成核，晶体生长和矿物的形态的调控。国内外学者已经证实，有机分子对羟基磷灰石等晶体的成核和晶体结构起着引导作用。如，牙釉质中的釉原蛋白，被证实可以促进牙釉质表面再矿化。但是这些有机大分子，分子结构复杂，具体应用时环境条件要求苛刻，同时蛋白的生产提纯费用昂贵。因此找出能够与无机物晶体特异性结合并能调控其矿化过程的小分子多肽具有相当的应用前景。噬菌体表面展示技术可以筛选出能够与无机物特异性结合并且调控无机物矿化过程的小分子多肽(7-12个氨基酸序列)。学者们已经筛选出包括羟基磷灰石在内的许多无机物特异性结合的多肽。但由于这些筛选过程中由于忽略了作为筛选基底的晶体的各向异性特征，这些多肽的调控作用缺乏特异性。本研究利用随机七肽噬菌体展示文库，筛选能与牙釉质表面特异性结合的七肽，在国内外尚未报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是应用噬菌体表面展示技术，筛选出一种能与牙釉质表面轴向特异性结合的七肽。当龋病发生牙釉质脱矿，羟基磷灰石晶体大量暴露，与牙釉质表面晶体特异性结合的多肽相应增加，该多肽若融合某些可检测分子(荧光蛋白)可作为脱矿开始的诊断工具(即龋病的早期诊断)。本专利技术的另一目的是利用该多肽对脱矿牙釉质表面再矿化过程的作用，将该多肽用于龋坏牙体再矿化修复。该专利技术通过以下技术方案实现本专利技术应用随机七肽噬菌体展示文库对牙釉质表面进行了 4轮筛选，获得能与牙釉质表面特异性结合的重组噬菌体，从得到的重组噬菌体分离制备单克隆噬菌体，提取单克隆噬菌体单链基因组DNA，共获得了 32个七肽，通过Output/Input比值比较不同单克隆噬菌体的结合能力，获得了能与牙釉质表面轴向特异性结合，结合力最高的七肽，其氨基酸序列如下Asn-Asn-His-Tyr-Leu-Pro-Arg。实验表明该七肽对脱矿牙釉质表面再矿化具有促进作用，可用于龋坏牙体再矿化修复。本专利技术的优点是1、本专利技术制备的与牙釉质表面轴向特异性结合的七肽，能与牙釉质表面特异性结合，尤其是酸蚀后的牙釉质表面，该七肽可应用于龋病的诊断。2、本专利技术制备的七肽具有促进酸蚀牙釉质表面再矿的作用，可用于龋坏牙体再矿化修复。附图说明图1 是四轮筛选所获得的洗脱噬菌体的滴度。图2 是单克隆噬菌体E-I至E-32对牙釉质表面的结合力。图3 是与牙釉质表面特异性结合能力最强的七肽EHBP的氨基酸序列结构式。图4 是EHBP与不同牙釉质表面(未酸蚀，酸蚀，纵剖面)结合时的荧光强度比较。 其中图4(A)未酸蚀牙釉质表面未结合七肽EHBP时的荧光图；图4(B)未酸蚀牙釉质表面结合七肽EHBP的荧光图；图4(C)酸蚀牙釉质表面未结合七肽EHBP的荧光图；图4(D)酸蚀牙釉质表面结合七肽EHBP的荧光图；图4(E)牙釉质纵剖面未结合七肽EHBP的荧光图；图4(F)牙釉质纵剖面结合七肽EHBP的荧光图。图5 是不同七肽对酸蚀牙釉质表面的再矿化的促进作用比较(电镜图)。其中图 5(A)酸蚀牙釉质表面未加入任何多肽再矿化16h;图5 (B)酸蚀牙釉质表面未加入任何多肽再矿化Mh ；图5 (C)酸蚀牙釉质表面加入随机多肽RP后再矿化16h ；图5 (D)酸蚀牙釉质表面加入随机多肽RP后再矿化24h ；图5(E):酸蚀牙釉质表面加入低结合力多肽ELBP后再矿化16h ；图5(F)酸蚀牙釉质表面加入低结合力多肽ELBP后再矿化Mh ；图5(G)酸蚀牙釉质表面加入高结合力多肽EHBP后再矿化16h ；图5(H)酸蚀牙釉质表面加入高结合力多肽EHBP后再矿化Mh。具体实施例方式以下结合说明书附图和实施例对本专利技术作进一步的说明，但不是限制本专利技术。实施例1 与牙釉质表面轴向特异性结合的重组噬菌体的筛选1.第一轮筛选与洗脱1)取正畸原因拔除前磨牙，去除牙齿表面附着软组织，将前磨牙放入蒸馏水中超声清洗30分钟，经环氧乙烷消毒后备用。2)将消毒后的前磨牙放入封阻缓冲液(0. IM NaHCO3 ，5mg/ml BSA, 0. 02% NaN3),4°C过夜封阻。3)第二天，将经过过夜封阻的前磨牙取出，放入灭菌水，4°C继续封阻1小时。4)将牙齿悬吊于 M 孔板的一个孔中，用 500uL TBST (TBS+0. 1% Tween-20) 缓冲液快速冲洗牙齿6次。注意每次冲洗吸取TBST缓冲液后，再次加入TBST缓冲液要快，避免牙齿干燥。5)经过6次TBST缓冲液冲洗后，去除缓冲液，立即加入IOuL噬菌体原库(10"pfu) (噬菌体试剂盒购自New England Biolabs公司)和490uL TBST缓冲液的混合溶液。注意控制牙齿悬吊高度，以保证液体仅浸泡牙釉质表面，不超过牙冠部分。室温下置于摇床温和摇动结合40分钟。6)吸掉噬菌体原库和TBST混合溶液，用500uL TBST缓冲液快速冲洗牙齿10次。 具体注意事项同步骤4)。7)吸掉 TBST 缓冲液，加 IOOOuL 洗脱缓冲液(0. 2M Glycine-HCl ，lmg/ml BSA)洗脱结合的噬菌体，室温下置于摇床温和摇动10分钟。立即将洗脱噬菌体液转移至另一干净微量离心管，然后再用150uL Tris-HCl (ΙΜ,ρΗ 9. 1)中和上述洗脱噬菌体液。4°C保存直到用于噬菌体滴度测定或扩增用于下一轮筛选。2.扩增，第二，三，四轮筛选与洗脱1)准备5mL LB-Tet培养基(LB培养基并加入5uL四环素贮液)放入15mL离心管。枪头挑取ER2378菌落一个，放入培养基，置于37°C恒温摇床，230rpm，过夜培养。2)第二天，将ER2738细菌过夜培养物1 100稀释于20mLLB培养基中(用250mL 三角烧瓶盛装)，37°C恒温摇床，230rpm,预培养1小时。3)加入200uL未扩增洗脱噬菌体液，37°C恒温摇床，250rpm,培养4. 5小时.4)转移培养物至50mL高速离心管，4°C，10，OOOrpm,离心10分钟。上清液转移至新离心管，相同条件下再次离心。5)将上清的上部80%转移至新离心管，加入1/6体积的PEG/NaCl溶液，4°C过夜沉淀。6)第三天，4°C，10，OOOrpm，离心15分钟。倒掉上清液，再短暂离心，吸去残留上清液。7)沉淀物重悬于Im本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种与牙釉质表面轴向特异性结合的七肽，其氨基酸序列如下：Ａｓｎ－Ａｓｎ－Ｈｉｓ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周彬，龚士强，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属同济医院，
类型：发明
国别省市：83
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