一种含杯状细胞的重组眼结膜上皮膜片的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种含杯状细胞的重组结膜上皮膜片的制备方法，是用γ-分泌酶抑制剂来诱导杯状细胞的分化。本发明专利技术的制备方法以自体结膜或异体结膜为原材料，培养制备含杯状细胞的重组结膜上皮膜片。与以往的结膜上皮膜片制备方法相比，本发明专利技术的培养方法能在早期促进结膜上皮细胞的增殖，形成的结膜上皮复层更加均匀；以羊膜嵌套式培养模具为培养支架，羊膜培养面很平坦，分化的杯状细胞存在于结膜上皮间，具有功能，临床应用方便且羊膜不易破裂；并且可增加重组结膜上皮膜片中杯状细胞的密度和分泌黏蛋白的能力，更符合临床需求。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于眼表结膜上皮制备
，具体涉及到。
技术介绍
结膜杯状细胞是单细胞黏液腺，位于结膜上皮层，其主要功能是分泌黏蛋白，其所分泌的黏蛋白是泪膜最内层的主要成分，对维持眼表功能起重要作用。但是，若杯状细胞受到破坏，泪液成分即出现异常，引起角结膜干燥症，轻者感觉不适，重者导致失明。因此，在结膜大范围损伤后，即使采用口唇粘膜、羊膜移植等种种方法克服睑球粘连问题，也会因为不能恢复正常的杯状细胞密度和功能，不能建立后期角膜移植术恢复视力的基础。因此，制备含杯状细胞的重组结膜上皮膜片，用以重建结膜结构和功能，恢复作为泪液中黏蛋白主要来源的杯状细胞，已成为眼表重建手术一个新的发展方向，其临床应用将为眼表疾病的治疗开辟广阔前景，具有深远意义。但目前对含杯状细胞的重组眼结膜上皮膜片的构建中还存在许多难题亟待解决。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，即在结膜上皮膜片构建的后期，采用Y _分泌酶抑制剂诱导杯状细胞分化，增加重组眼结膜上皮膜片中杯状细胞的密度，促进其成熟分化，得到含正常功能和密度杯状细胞的重组结膜上皮膜片，以弥补现有技术的不足。本专利技术的含杯状细胞的重组眼结膜上皮膜片的制备方法，其特征在于，是用 Y-分泌酶抑制剂来诱导重组眼结膜上皮膜片中杯状细胞的分化。本专利技术的制备方法，包括有1)眼结膜上皮膜片的培养制备和2)杯状细胞诱导分化成熟步骤，其特征在于，上述2)杯状细胞诱导分化成熟步骤是在结膜上皮细胞培养液中加入终浓度为100 400nm/L的γ -分泌酶抑制剂来诱导杯状细胞的分化。上述的步骤1)眼结膜上皮膜片的培养制备，其步骤如下首先将制备好的羊膜嵌套式培养模具放入已铺有饲养层的培养板中，然后再将处理好的结膜上皮组织接种于培养板中，再添加结膜上皮细胞培养液进行培养。所述的饲养层制备方法如下用丝裂霉素C处理小鼠胚胎成纤维细胞后，再消化接种到细胞培养用的6孔板中制备小鼠胚胎成纤维细胞饲养层。步骤2)杯状细胞诱导分化成熟，其步骤如下将结膜上皮组织接种于培养板中培养至结膜上皮细胞融合度达到80 90 %后，在结膜上皮细胞培养液中加入终浓度为100 400nm/L的Y -分泌酶抑制剂，诱导分化结膜上皮细胞1 7天，制得含杯状细胞的眼重组结膜上皮膜片。在结膜上皮细胞培养液中加入终浓度为200nm/L的γ -分泌酶抑制剂，结膜杯状细胞明显增殖，具有最好的诱导效果。本专利技术的制备方法以自体结膜或异体结膜为原材料，培养制备含杯状细胞的重组结膜上皮膜片，用于移植治疗因为杯状细胞缺乏或功能障碍为特征的眼表疾病。本专利技术以 Y -分泌酶抑制剂诱导杯状细胞分化，与以往的结膜上皮膜片制备方法相比，本专利技术的培养方法具有如下优点1)含饲养层细胞培养，早期促进结膜上皮细胞的增殖，形成的结膜上皮复层更加均勻；2)以羊膜嵌套式培养模具为培养支架，羊膜培养面很平坦，分化的杯状细胞存在于结膜上皮间，具有功能，临床应用方便且羊膜不易破裂；3) Y-分泌酶抑制剂诱导杯状细胞分化，可增加重组结膜上皮膜片中杯状细胞的密度和分泌黏蛋白的能力，更符合临床需求。附图说明图1 本专利技术的膜嵌套式培养模具的结构示意图。图2 本专利技术的原代培养兔结膜上皮细胞阴性对照组处理照片。图3 本专利技术的原代培养兔结膜上皮细胞200nm/L的γ -分泌酶抑制剂组处理照片。图4:本专利技术的原代培养人结膜上皮细胞阴性对照组AB/PAS染色照片，红色着色为杯状细胞。图5 本专利技术的原代培养人结膜上皮细胞200nm/L的γ -分泌酶抑制剂组AB/PAS 染色照片，红色着色为杯状细胞。其中1、嵌入式培养小室2、套筒3、羊膜片。具体实施例方式本专利技术以自体结膜或异体结膜组织为原材料，用Y _分泌酶抑制剂诱导杯状细胞分化来制备以羊膜为载体的结膜杯状细胞膜片，制备的含杯状细胞的眼重组结膜上皮膜片具有人结膜杯状细胞的特性，可用于结膜杯状细胞缺乏或功能障碍征疾病的移植治疗中。本专利技术的制备方法包括有1)眼结膜上皮膜片的培养制备和2)杯状细胞诱导分化成熟步骤，其特征在于，上述2)杯状细胞诱导分化成熟步骤是在结膜上皮细胞培养液中加入终浓度为100 400nm/L的γ -分泌酶抑制剂。本专利技术的1)眼结膜上皮膜片的培养可以采用已有的方法来进行，优选方法参照于中国专利技术专利羊膜复合角膜缘干细胞膜片的制备方法(201110036633. 4)所描述的方法，具体步骤如下a、羊膜嵌套式培养模具的制备如图1，按照常规方法制备5. OcmX 5. Ocm尺寸的去上皮无菌羊膜片3，将该羊膜片 3上皮面朝上平铺于6孔培养板中；将上述得到的羊膜片3上皮面向下置于聚丙乙烯材料制成的套筒2的端面上，用嵌入式培养小室1扣在套筒2的羊膜片3上，即制成羊膜嵌套式培养模具。其中所用套筒2外径24mm，高16mm。b、小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的制备用0.01mg/ml丝裂霉素C溶液处理贴壁的小鼠胚胎成纤维细胞，37°C孵育2小时； 用IOml PBS磷酸盐缓冲液仔细清洗细胞后；加Iml 0. 25%胰酶/0. 02% EDTA，37°C孵育3-5分钟；加9ml含血清的DMEM培养液中止消化，吹打细胞；离心收集细胞，弃上清，用IOml 含胎牛血清的DMEM培养液重悬细胞；细胞计数，以2. 5 X IO4细胞/cm2的细胞密度接种细胞到6孔培养板中，37°C培养过夜使其贴壁，即制备成小鼠胚胎成纤维细胞3T3饲养层。C、结膜组织小块的制备将眼库来源的新鲜结膜组织环放入盛有含lOOu/ml青霉素和链霉素的PBS液中浸泡，冲洗3次，每次3分钟。移入含100u/ml青霉素和链霉素的DMEM培养液的培养皿中，实体显微镜下仔细剪除结膜下组织及血管组织，将结膜上皮组织修剪成大小Imm3的组织块。d、将上述步骤一制备的羊膜嵌套式培养模具放置入铺有上述步骤二制备的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的6孔板中，再将上述步骤三制备的结膜组织块接种于羊膜嵌套式培养模具羊膜面上，每个培养孔接种5-8块结膜组织块，加入少量结膜上皮细胞培养液，所述的结膜上皮细胞培养液为添加有10% FBS、20ng/mlEGF、5 μ g/ml胰岛素、0. 1 μ g/ml霍乱毒素、100 μ g/ml青链霉素的DMEM/HamF12培养基，放置于37°C培养箱中培养。培养24小时后细胞从组织块向外爬出，培养一周左右结膜上皮细胞生长至50 60%融合，10天左右结膜上皮细胞生长至80 90%融合。本专利技术的方法步骤2)杯状细胞诱导步骤利用针对Notch通路的靶向治疗剂 Y-分泌酶抑制剂诱导分化结膜上皮细胞，在原代培养的结膜上皮细胞中加入终浓度100、 200、400nm/L γ -分泌酶抑制剂，加入不含Y -分泌酶抑制剂的培养液做阴性对照，于加药后第3天，RAB/PAS染色，观察不同浓度组杯状细胞密度的差异；通过逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR)方法检测Y-分泌酶抑制剂对杯状细胞MUC5AC、CK7基因表达的影响。结果在体外培养的兔结膜上皮细胞中存在杯状细胞，且MUC5AC、CK7mRNA表达量明显高于阴性对照组，其中200nm处理组MUC5AC、CK7mRNA表达量明显高于100、400nm组。因此，本专利技术确定Y-分泌酶的最佳诱导浓度为200nm/L。下面对本专利技术的制备方法进行详细的描述。实施例1体外本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种含杯状细胞的重组眼结膜上皮膜片的制备方法，其特征在于，是用γ－分泌酶抑制剂来诱导重组眼结膜上皮膜片中杯状细胞的分化。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周庆军，谢立信，王瑶，杨玲玲，田乐，
申请(专利权)人：山东省眼科研究所，
类型：发明
国别省市：95