本发明专利技术公开了基于磁原位扩增的电化学发光基因传感器检测食品致病菌的方法。首先根据食品致病菌的高保守性DNA序列作为检测目的片段，设计三条PCR引物，然后由引物1制备得到磁性引物，由引物2制备得到TBR引物，引物3为普通的PCR引物，当检测体系里存在目标基因片段时，随着PCR过程的进行，磁性引物会发生扩增，磁性粒子上便直接带有三联吡啶钌分子修饰的双链核酸产物。当没有目的基因片段存在下，磁性引物不会发生扩增，因而不会出现带有信号分子的产物。之后再通过磁分离和原位的电化学发光检测手段，此方法实现了快速，高灵敏，安全，特异的检测目的基因片段的目的，很适合在实际检测的过程中得到推广。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于电化学发光基因检测
，特别涉及一种。
技术介绍
食源性致病菌作为一个严重的公共卫生问题是影响食品安全的主要原因之一。它严重危害人们的生命健康并造成重大经济损失。据世界卫生组织2002年3月公布的信息表明，全球每年发生食源性疾病达到数十亿例，全球每年因食源性致病菌污染引起的腹泻而死亡的儿童约170万。我国每年报告的食源性疾病病例约2-4万人，但据专家估计这一数字尚不到实际数字10%。2008年的广东省卫生厅的数据也显示，省内食物中毒死亡人数为884人，其中细菌性污染引起的食物中毒死亡占60. 97%。我国的外贸出口也因为食品安全问题而面临严峻的外部环境。特别需要引起重视的是进口国，用贸易技术壁垒限制中国产品出口，保护其本国产业的趋势越来越明显。发展一种快速，灵敏，特异，安全的检测食源性致病菌的方法一直是研究的热点。综合传统的食源性的致病菌的检测方法，主要有基因检测方法，免疫学检测方法，涂平板检测法，以及电子显微镜观察法。相对于基因水平的检测方式，这些方法往往有着特异性不高，灵敏度低，耗时长，仪器昂贵的缺点。目前，常规的基因检测手段包括有聚合酶链式反应(PCR)-电泳方法，分子灯塔技术，荧光能量传递技术(Taqman探针技术，LightCycler探针技术，Amlisensors探针技术， 复合探针技术)。这些方法却存在各自的不足，如性噪比不高，荧光背景干扰，需要使用有毒的物质，步骤繁琐等。
技术实现思路
为了克服现有的方法存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种基于磁原位PCR与电化学发光检测技术结合的快速、高灵敏度、准确、操作简便的食品致病菌分析方法。该技术通过针对靶基因设计三条PCR功能引物。当存在检测的目的基因片段时，借助磁性粒子表面上的引物(即磁性引物)的扩增，生成的带有三联吡啶钌(Ru(bpy)32+JPTBR)信号分子标记的产物会直接被富集在磁性粒子的表面；而不含目的片段时，磁性引物不会发生扩增，磁性粒子的表面并不会带有三联吡啶钌信号分子；而后借助原位的电化学发光检测装置进行检测，通过电化学发光值的强弱即可判断目的基因片段的有无。本专利技术的目的通过以下技术方案实现，，具体包括以下步骤，其特征在于具体包括以下步骤(1)设计引物根据食品致病菌的保守序列进行设计，每种食品致病菌的检测引物为3条，分别命名为引物1、引物2和引物3，其中引物1的5’端修饰有功能基团和连接子，连接子为不影响PCR反应特异性的随机 DNA序列；引物2的5’端修饰有功能基团；引物3为普通的PCR引物；(2)制备磁性引物和TBR引物引物1通过其功能基团与功能化的磁性粒子上的功能基团反应，得到磁性引物；引物2通过其功能基团与活化的三联吡啶钌进行反应，得到 TBR引物；(3)PCR反应模板为待测样品DNA，引物为引物3以及步骤⑵制备的磁性引物和 TBR引物；(4)分离纯化将步骤(3)所得的PCR产物进行分离纯化，得到带有三联吡啶钌的 PCR产物的磁性粒子；(5)检测在带有三联吡啶钌的PCR产物的磁性粒子中加入分析液，电化学发光检测仪器检测带有三联吡啶钌的PCR产物的磁性粒子的电化学发光信号即ECL信号，ECL信号值高于阈值即表明样品中含有食品致病菌，根据引物的种类即可判断样品中的食品致病菌的种类。由于避免了电极修饰等步骤，样品池实现反复利用，可以快速的进行下一组样品的检测。步骤(1)中所述的食品致病菌的保守序列优选为食品致病菌的16S-23S启动子间基因片段或某一细菌的毒力基因片段，如单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)表达溶素0的基因(HlyA)，沙门氏杆菌(Salmonella enterica)的侵袭基因A(invA)；引物1中所述的功能基团优选为氨基、羧基、磷酸基、生物素、链霉亲和素、羟基或巯基；弓丨物2中所述的功能基团优选为氨基；引物3为核苷酸序列，其与引物2预扩增得到的片段包含或相同于引物1与引物 2扩增得到的片段；步骤(1)中所述的食品致病菌为单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)时，针对其16S-23S启动子间基因片段所设计的三条PCR引物分别是；引物 1 为 5，-NH2- (CH2) 6-TTTTTTTTGGCCTATAGCTCAGCTGGTTAGA_3，，TTTTTTTT 为降低磁性引物空间位阻效应的聚胸腺嘧啶的链接子(poly-thymine linker), 引物 2 为 5，-NH2- (CH2) 6-GCTGAGCTAAGGCCCCGTAAA_3，，引物 3 为 5，-GGCCTATAGCTCAGCTGGTTAGA-3，；步骤(2)中所述功能化的磁性粒子中的功能基团优选为氨基、羧基或巯基；其功能基团是能与引物1上的功能基团进行反应；步骤(2)中所述功能化的磁性粒子粒径为20nm-10 μ m ；步骤⑵中所述的磁性引物的具体制备方法如下将引物1与处理后的功能化的磁性粒子在连接反应液中孵育，纯化，清洗，得到磁性引物；所述功能化的磁性粒子的处理步骤优选为先用0. OlM氢氧化钠溶液清洗，然后用去离子水冲洗；所述的连接反应液的各组分及各组成在体系中的终浓度如下所示2_吗啉乙磺酸(MES) 0. 1M，吐温-20体积的分比0. 25%，碳二亚胺盐酸盐(EDC) IOmM, pH值为5. 0 ；所述的孵育的条件优选为室温条件反应3小时；所述的纯化优选通过磁性分离笔分离磁性引物，如Bio-Nobile牌的Pickpen ；所述的清洗的溶液如下10mM，pH7. 4的PBS中加入吐温-20,吐温-20的终浓度为体积百分比0. 25% ；步骤(2)中所述的TBR引物的具体制备方法如下将引物2与三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺脂(TBR-NHS ester)按摩尔比1 2 1 3在碱性条件下避光孵育，以使引物2中的功能基团和TBR-NHS ester进行连接反应，得到TBR引物，洗涤并沉淀标记TBR 引物，最后用纯水再次溶解TBR引物。所述的孵育的条件为10 60°C，3小时；所述的洗涤的溶液优选为体积比70% -100%的乙醇溶液。步骤(3)中所述的磁性引物的质量与PCR缓冲液的体积比为0.2 μ g/μ L，引物3 的物质的量是TBR引物物质的量的5% ；PCR反应缓冲液为与所用Taq酶相配的缓冲液，另外加入如下物质以及如下物质在PCR反应缓冲液中的终浓度为=TritonX-IOO体积百分比0. 1%，Tween-20体积百分比 0.5%，牛血清蛋白(BSA)质量百分比0.05% ；步骤(3)中所述的PCR反应的条件优选为93°C 2分钟；93°C 10秒，56°C 15秒， 720C 15秒，45个循环，72°C后延伸2分钟。步骤(4)中所述的分离纯化优选通过磁性分离笔进行分离，使用的纯化缓冲液为如下10mM，pH7. 4的PBS中含有终浓度为体积百分比0. 25%的吐温-20。步骤(5)中所述的分析液的组成如下112mM KH2PO4,88mMK2HP04 · 3H20, 50 μ M NaCl,6. 5mM NaN3,0. 8μ M Tirton X-100,0. 4mMTween-20, IOOmM TPA ；步骤(5)中所述的检测条件为电本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种基于磁原位扩增的电化学发光基因传感器检测食品致病菌的方法，其特征在于包括以下步骤：（１）设计引物：根据食品致病菌的保守序列进行设计，每种食品致病菌的检测引物为３条，分别命名为引物１、引物２和引物３，其中：引物１的５’端修饰有功能基团和连接子，连接子为不影响ＰＣＲ反应特异性的随机ＤＮＡ序列；引物２的５’端修饰有功能基团；引物３为核苷酸序列，其与引物２预扩增得到的片段包含或相同于引物１与引物２扩增得到的片段；（２）制备磁性引物和ＴＢＲ引物：引物１通过其功能基团与功能化的磁性粒子上的功能基团反应，得到磁性引物；引物２通过其功能基团与活化的三联吡啶钌进行反应，得到ＴＢＲ引物；（３）ＰＣＲ反应：模板为待测样品ＤＮＡ，引物为引物３以及步骤（２）制备的磁性引物和ＴＢＲ引物；（４）分离纯化：将步骤（３）所得的ＰＣＲ产物进行分离纯化，得到带有三联吡啶钌的ＰＣＲ产物的磁性粒子；（５）检测：在带有三联吡啶钌的ＰＣＲ产物的磁性粒子中加入分析液，电化学发光检测仪器检测带有三联吡啶钌的ＰＣＲ产物的磁性粒子的ＥＣＬ信号，ＥＣＬ信号值高于阈值即表明样品中含有食品致病菌，根据引物的种类即可判断样品中的食品致病菌的种类。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邢达，朱啸，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：81
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