一种老年性痴呆疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种老年性痴呆疫苗及其制备方法，它包括至少一个耦联到载体蛋白或载体多肽形成耦联物的包含Ａβ＃－［４２］的中和表位的人工合成的多肽。其制备方法，包括以下步骤：（１）人工合成至少一条含有Ａβ＃－［４２］的中和表位的多肽；（２）将上述多肽分别耦联到载体蛋白或载体多肽上形成耦联物，耦联物经孵育老化；（３）将上述耦联物配以可接受的佐剂制备成老年痴呆Ａβ＃－［４２］亚单位疫苗。本发明专利技术的疫苗既去除了共有的毒性片断，从而改进疫苗结构，增强免疫原性，又保留了有效抗原决定簇。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用生物技术制备的疫苗及其制备方法，特别是。用Aβ42的完整片段作为免疫原，存在以下几个问题(1)Aβ42肽含有Aβ毒性片段(25～35位氨基酸)，其用作免疫原的安全性受到质疑；(2)Aβ的β片层结构是脑内Aβ沉积物和老年斑中Aβ多肽存在的重要形式，而人工合成的Aβ42需经过变构才具有较好的免疫原性；(3)Aβ42肽分子量＜10000，免疫原性差。为实现上述目的，本专利技术采取以下设计方案一种合成肽Aβ42亚单位疫苗，它包括至少一条耦联到载体蛋白或载体多肽形成耦联物的含有Aβ42的中和表位的人工合成的多肽。其中，所述中和表位的人工合成的多肽可以是以下七种之一、或其中之二或更多种(1)Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln(Aβ1～15)(2)Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala(Aβ36～42)(3)Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr(Aβ4～10)(4)Glu-Phe-Arg-His(Aβ3～6)(5)Asp-Ala-Glu-Phe-Arg(Aβ1～5)(6)Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu(Aβ1～11)(7)Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys(Aβ22～28)其中采一种的为单一亚单位疫苗，采两种或两种以上的为多联亚单位疫苗。其中，耦联剂可以是载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)，或载体多肽多重抗原肽系统(multiple antigens peptide system，MAPs)，寡聚赖氨酸是一个理想的MAPs核心框架，如七聚赖氨酸(heptalysine)，因为七聚赖氨酸本身无抗原性，避免了载体蛋白如BSA带来的过敏反应，使免疫反应特异性更强，安全性更好；同时，由于其本身分子小，位于大分子复合物的核心，不会封闭抗原表位的活性。又如三聚赖氨酸，十二聚赖氨酸等。为了适宜于注射，疫苗中还应该包括可接受的药用佐剂。如MF59(意大利政府1997年批准用于人体流感疫苗的佐剂)佐剂，铝佐剂等。本专利技术制备合成肽Aβ42亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤(1)人工合成至少一条可耦联到载体蛋白或载体多肽形成耦联物的包含Aβ42的中和表位的人工合成的多肽；(2)将上述多肽分别耦联到载体蛋白或载体多肽上形成耦联物；(3)将上述耦联物配以可接受的佐剂制备成老年痴呆Aβ42亚单位疫苗。其中人工合成多肽的方法一般从C端(羧基端)向N端在(氨基端)合成。以往的多肽合成是在溶液中进行的。现在多数采用固相合成法，选用多肽固态合成仪，在合成柱上合成，从而大大减轻产品提纯的难度。为了防止副反应的发生，合成柱和添加氨基酸的侧链是被保护的。羧基端是游离的，并且在反应之前必须活化。化学合成法多采用Fmoc法。交联可以采用本领域的常用方法，如采用交联剂N-琥珀酰亚胺-M-马来酰亚胺基苯甲酸酯(MBS)交联，采用制备高效液相(HPLC)柱纯化，经质谱仪(MS)分析鉴定。本专利技术选择Aβ42的某些片段作为免疫原，这样既去除了共有的毒性片断，从而改进疫苗结构，增强免疫原性，又保留了有效抗原决定簇。实施例1 制备以中和表位1为基础的合成肽Aβ42亚单位疫苗，包括以下步骤(1)利用多肽固态合成仪人工合成中和表位1的多肽Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln(Aβ1～15)，过柱纯化到95％以上；(2)利用交联剂MBS(M-maleimidobenzoyl-N-hydroxy succinimideester)，将多肽与载体七聚赖氨酸(heptalysine)的支链耦联，并经过孵育；经HPLC色谱纯化到95％以上；以灭菌的0.0lmol/L PBS(pH7.4)稀释抗原；(3)将耦联物配以等体积的MF59佐剂，用旋涡振荡器混匀约30min，制备成疫苗。实施例2 制备以中和表位2为基础的合成肽Aβ42亚单位疫苗，包括以下步骤(1)人工合成中和表位2的多肽Val-Gly-Gly-Val-Val-lle-Ala(Aβ36～42)(2)利用交联剂MBS(M-maleimidobenzoyl-N-hydroxy succinimideester)，将多肽与载体七聚赖氨酸(heptalysine)的支链耦联，并经过孵育；(3)将耦联物配以铝佐剂制备成疫苗。实施例3 制备以中和表位3为基础的合成肽Aβ42亚单位疫苗，包括以下步骤(1)人工合成中和表位3的多肽Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr(2)利用交联剂MBS(M-maleimidobenzoyl-N-hydroxy succinimideester)，将多肽与载体七聚赖氨酸(heptalysine)的支链耦联，并经过孵育；(3)将耦联物配以MF59佐剂制备成疫苗。实施例4 制备以中和表位4为基础的合成肽Aβ42亚单位疫苗，包括以下步骤(1)人工合成中和表位4的多肽Glu-Phe-Arg-His(2)利用交联剂MBS(M-maleimidobenzoyl-N-hydroxy succinimideester)，将多肽与载体七聚赖氨酸(heptalysine)的支链耦联，并经过孵育；(3)将耦联物配以MF59佐剂制备成疫苗。实施例5 制备以中和表位5为基础的合成肽Aβ42亚单位疫苗，包括以下步骤(1)人工合成中和表位5的多肽Asp-Ala-Glu-Phe-Arg(2)利用交联剂MBS(M-maleimidobenzoyl-N-hydroxy succinimideester)，将多肽与载体七聚赖氨酸(heptalysine)的支链耦联，并经过孵育；(3)将耦联物配以铝佐剂制备成疫苗。实施例6 制备以中和表位6为基础的合成肽Aβ42亚单位疫苗，包括以下步骤(1)人工合成中和表位6的多肽Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu(2)利用交联剂MBS(M-maleimidobenzoyl-N-hydroxy succinimideester)，将多肽与载体七聚赖氨酸(heptalysine)的支链耦联，并经过孵育；(3)将耦联物配以MF59佐剂制备成疫苗。实施例7 制备以中和表位7为基础的合成肽Aβ42亚单位疫苗，包括以下步骤(1)人工合成中和表位7的多肽Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys(2)利用交联剂MBS(M-maleimidobenzoyl-N-hydroxy succinimideester)，将多肽与载体七聚赖氨酸(heptalysine)的支链耦联，并经过孵育；(3)将耦联物配以铝佐剂制备成疫苗。实施例8 制备以Aβ1-15和Aβ36-42为基础的合成肽多联疫苗，包括以下步骤(1)人工合成中和表位1的多肽Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln(2)利用交联剂MBS(M-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimid本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种老年性痴呆疫苗，它包括至少一个耦联到载体蛋白或载体多肽形成耦联物的包含Ａβ↓［４２］的中和表位的人工合成的多肽。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：姚志彬，
申请(专利权)人：姚志彬，中山大学中山医学院科技开发中心，中炬高新技术实业集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]