感染病治疗剂制造技术

本发明专利技术人发现了一条新的路径，其中本身没有细胞毒性的１５Ｋ颗粒溶解酶被掺入至巨噬细胞中并被活化，从而杀伤进入巨噬细胞内的细菌。本发明专利技术人还发现采用上述１５Ｋ颗粒溶解酶作为活性成分可提供一种有效的感染病治疗剂，该治疗剂几乎没有副作用，细菌对其难以产生耐药性，即提供一种含有作为活性成分的１５Ｋ颗粒溶解酶的感染病治疗剂。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及对诸如肺结核等感染病进行治疗的感染病治疗剂。
技术介绍
在医疗保健方面，毫无疑问，感染病治疗剂是必不可少的。目前有许多用于感染病的治疗剂，诸如抗生素以及合成抗菌素等，并将这些治疗剂用于医疗保健。但是，目前主要的用作感染病治疗剂的抗菌剂实际上具有一个不可避免的问题，即耐药性细菌的出现。也就是说，持续着这样一种严峻的状态一旦提供了一种新的抗菌剂，则随之产生了一种新的耐药性细菌。例如，单一感染病中死亡率占第一位的肺结核最近具有增加的倾向，这已经成为一个世界性的问题。此外，已经证实了对几乎所有抗菌素具有抗性的耐药性细菌的存在，这一问题已经被揭露。近来，已经揭示，在自然杀伤细胞(NK细胞)或者细胞毒性T淋巴细胞(CTL)中表达的一种叫做颗粒溶解酶分子具有直接杀伤诸如结核分支杆菌等细菌的能力[Stenger，S.et al.，Science 282，121-125(1998)]。颗粒溶解酶首先被制成15K的一个前体，然后在细胞毒性颗粒内被加工成9K颗粒溶解酶，已知这种9K的颗粒溶解酶具有抗菌活性(Pena，S.V.et al.，J.Immunol，158，2680-2688(1997))。此外，还报道了一种穿孔素刺穿靶细胞的一条路径，其中穿孔素为源于同样的细胞毒性颗粒内的分子，颗粒溶解酶通过该路径进入细胞内，在细胞内杀伤感染细菌[Stenger，S.et.al.，Science 282，121-125(1998)]。因此，认为颗粒溶解酶在防御感染中发挥了重要的作用。很难想到活性型的9K颗粒溶解酶使细菌获得耐药性，可以考虑采用与抗生素具有不同特征的感染病治疗剂。此外，最近怀疑9K颗粒溶解酶除去细胞内感染细菌的穿孔素路径的存在(David，H.C.et al.，J.Immunol，167，2734-2742(2001))。并且，已认识剑该分子的细胞毒性(Pena，S.V.etal.，J.Immunol，158，2680-2688(1997))，当施用时，恐怕会产生相当大的毒副作用。本专利技术要解决的一个问题就是详细研究颗粒溶解酶，并为使用该颗粒溶解酶作为感染病治疗剂提供手段。
技术实现思路
为了解决这一问题，本专利技术人进行了详细的研究。结果，本专利技术人发现了一条新的路径，在该路径中，15K颗粒溶解酶被掺入到巨噬细胞中，然后被活化，从而杀伤被吞噬进巨噬细胞中的细菌。也就是说，本专利技术人发现采用本身没有细胞毒性的15K颗粒溶解酶作为活性成分可能为感染提供一种有效的治疗剂，其几乎没有副作用，并且很难使细菌获得耐药性。本专利技术提供了一种活性成分为15K颗粒溶解酶的感染病治疗剂(下文将称之为本专利技术治疗剂)。再有，在本专利技术中，所谓15K颗粒溶解酶是分子量为15,000(15k)的一种蛋白质，其含有145个氨基酸，位于上述的细胞毒性颗粒内。在细胞毒性颗粒内，切下15K颗粒溶解酶的一部分，结果15K颗粒溶解酶以分子量为9,000(9k)的蛋白质的形式存在(Pena，S.V.，et al.，J.Immunol.，158，2680-2688(1997)，Stenger，S.，et al.，Science，282，121-125(1998))。附图说明图1显示了15K颗粒溶解酶对结核杆菌的抗菌作用研究的结果。具体实施例方式下面将对本专利技术的实施方案进行描述。A.本专利技术治疗剂的活性成分可将从生物体分离的15K颗粒溶解酶作为本专利技术治疗剂的活性成分，但是由于15K颗粒溶解酶是生物体内的痕量成分，因此优选使用通过编码15K颗粒溶解酶的基因表达得到的重组蛋白。此外，还有一种在生物体内产生15K颗粒溶解酶的适宜方法，即利用其中插入了编码15K颗粒溶解酶的基因的15K颗粒溶解酶的体内表达载体，从而产生作为活性成分的15K颗粒溶解酶。①15K颗粒溶解酶的重组蛋白质已经报导了编码15K颗粒溶解酶基因的序列(Jongstra，et al.，J.Exp.Med，165，601)，具体地，报导了具有SEQ ID NO1的核苷酸序列的基因以及具有与之相应的氨基酸序列的15K颗粒溶解酶蛋白。据此，有效制备了编码15K颗粒溶解酶的基因，通过表达该基因能够制备15K颗粒溶解酶的重组蛋白质。具体地，利用与编码15K颗粒溶解酶的基因序列的两端互补的核苷酸链作为扩增引物，通过诸如PCR方法等基因扩增方法来制备编码15K颗粒溶解酶基因的基因扩增产物。将其转导至适宜的基因表达载体中，通过将该重组载体转染到诸如大肠杆菌、枯草杆菌、酵母、以及昆虫细胞等适宜的宿主内，由此而得到所需的15K颗粒溶解酶。本专利技术所用的基因表达载体优选采用通常在待表达基因的上游区域具有启动子和增强子，并在该基因的下游区域具有转录终止序列的载体。此外，并不限于只采用直接表达系统来表达15K颗粒溶解酶基因。例如，也可利用β-半乳糖苷酶基因、谷胱甘肽-S-转移酶基因、或者硫氧化还原蛋白基因等融合蛋白表达系统。对于采用大肠杆菌作为宿主的基因表达载体，有诸如pQE，pGEX，pT7-7，pMAL，pTrxFus，pET，以及pNT26CII等示例。对于采用枯草杆菌作为宿主的载体，有诸如pPL608，pNC3，pSM23，以及pKH80等示例。此外，对采用酵母作为宿主的载体，有诸如pGT5，pDB248X，pART1，pREP1，YEp13，YRp7以及YCp50等示例。另外，对采用哺乳动物细胞或者昆虫细胞作为宿主的载体，有诸如p91023，pCDM8，pcDL-SRα296，pBCMGSNeo，pSV2dhfr，pSVdhfr，pAc373，pAcYM1，pRc/CMV，pREP4以及pcDNAI等示例。可以根据15K颗粒溶解酶表达的目的来选择基因表达载体。例如，当表达15K颗粒溶解酶时，优选选择大肠杆菌、枯草杆菌或酵母为宿主的基因表达载体。当表达虽然量很小但仍具有确切活性的15K颗粒溶解酶时，优选采用哺乳动物细胞或者昆虫细胞做宿主的基因表达载体。此外，既可以选择上述现有的基因表达载体，当然也可根据目的来制备适宜的基因表达载体并采用该载体。将插入15K颗粒溶解酶基因的基因表达载体转染至宿主细胞中。所采用的转染方法可以是常规方法，例如，当采用大肠杆菌或枯草杆菌作为宿主细胞时，可采用氯化钙方法和电穿孔方法，当采用哺乳动物细胞或昆虫细胞作为宿主时，可采用磷酸钙方法以及电穿孔方法和脂质体方法。根据常规方法对得到的转化株进行培养，积聚所需的15K颗粒溶解酶。可根据宿主正确选择培养介质。例如，当采用大肠杆菌作为宿主时，可恰当选择LB和TB培养基。当采用哺乳动物细胞为宿主时，可恰当选择RPMI1640培养基。可根据常规方法从所得培养物中分离纯化所得的15K颗粒溶解酶。例如，可利用15K颗粒溶解酶的物理和/或化学性质对培养物进行多种处理从而进行分离纯化。具体地，可利用蛋白沉淀剂、超滤、凝胶过滤、高效液相色谱、离心、电泳、利用特异性抗体的亲合色谱、以及透析等处理，这些方法可以单独使用，也可以组合使用。可按照上述方法分离、纯化15K颗粒溶解酶。在感染病治疗剂中采用15K颗粒溶解酶作为活性成分，将其掺入血液的巨噬细胞中，在此被活化后而杀伤被巨噬细胞吞入其中能引起感染的细菌、病毒以及真菌，籍此可治疗这些微生物所引起的感染。如上所述，与9K颗本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种感染病治疗剂，其含有作为活性成分的１５Ｋ颗粒溶解酶。

【技术特征摘要】
JP 2002-2-22 45865/20021.一种感染病治疗剂，其含有作为活性成分的15K颗粒溶解酶。2.权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：冈田全司，高森请，小川一行，永田钦也，
申请(专利权)人：独立行政法人国立病院机构，冈田全司，高森靖，株式会社AZ生物器材，
类型：发明
国别省市：JP[日本]