乙肝疫苗的制备方法及用途技术

新型乙肝疫苗的制备方法及用途，其基本特征在于将市售的无佐剂的乙肝疫苗吸附于纳米铝佐剂上，所生成的新型乙肝疫苗，新型乙肝疫苗所采用的纳米铝佐剂的颗粒直径为１－９９９纳米，成分为氢氧化铝化合物，颗粒直径为１－９９９纳米的氢氧化铝化合物具有分散性好、不含杂质等优点，所用设备、工艺简单，是一种具有良好发展前途的制备方法，纳米铝佐剂增加１０－２０倍地吸附乙肝疫苗，形成了本发明专利技术所指的新型乙肝疫苗，本发明专利技术所指的新型乙肝疫苗具有明显的“瀑释”效应，在免疫后的前３周会产生明显的抗体应答。使用安全，注射部位基本无、甚至根本无炎症结节。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种人用乙肝疫苗及其制备方法，特别涉及含有纳米铝佐剂的乙肝疫苗及其制备方法。
技术介绍
乙肝疫苗的主要成分是HBsAg，等电点为4.5，HBsAg含有大量的磷酸基团。由于HBsAg和氢氧化铝佐剂的等电点(iep)分别为4.5和11.4。因此，在机体pH＝7.4的中性环境中，前者显示出负电荷，后者为正电荷，二者由于静电力，可以很好的产生吸附作用。铝佐剂吸附抗原的主要机制包括静电力、疏水作用以及基团交换[Vogel FR，Hem SL.InPlotkin SA，Orenstein MD，editors.Vaccines.4th ed.New YorkSanders]。由疏水作用产生的吸附，会受到因蛋白质折叠而减少暴露在水环境中疏水区域的限制。铝佐剂的氢氧根与抗原的磷酸根发生配体互换，产生了吸附作用[Bleam WF，Pfeffer PE，Goldberg S，et al.31P solid-state nuclear magneticresonance study of phosphate adsorption at the boehmite/aqueous solution interface.Langmuir.1991，71702-1712.]。磷酸根与铝在共价键的无机等价交换作用下，形成了内球表面。磷酸根对铝原子的连接比氢氧根更强，从而代替了氢氧根离子[Hingston FJ，Atkinson RJ，Quirk JP.Specific adsorption of anions.Nature(London).1967，2151459-1461.和Liu J，Feldkamp JL，White JL，et al.Adsorption of phosphateby aluminum hydroxycarbonate.J Pharm Sci.1984，731355-1358.]。Seema等[SeemaIyer，Robin Robinett RS，Harm HogenEsch，et al.Mechanism of adsorption ofhepatitis B surface antigen by aluminum hydroxide adjuvant.Vaccine.2004，241475-1479]发现二者的吸附性表现为高亲和吸附等温线。经兰米尔方程计算所得的吸附量为1.7微克每微克铝，这是指单层范围内的HBsAg数量，而吸附力强度指标，吸附系数为6.0毫升每微克。高吸附强度表明吸附是由于强吸附力，而HBsAg抗原的磷酸根与氢氧化铝佐剂的氢氧根，这两个配基之间的交换，提供了最强的吸附机制。通过增加离子强度不能影响吸附度，提示电荷吸引不是最主要的吸附力。通过增加乙二醇也不能影响吸附度，提示疏水作用同样不占主导作用。当氢氧化铝吸附HBsAg后，37℃条件下，在体外暴露于间质液中12小时，约5％的抗原解吸附。商业乙肝疫苗在48小时后，仅仅只有1％的抗原解吸附。所以，HBsAg与氢氧化铝的吸附在体内与体外的变化不大，所受到的解吸附作用极其微小。正是由于HBsAg与氢氧化铝的吸附不是由疏水作用、电荷吸引，而主要是HBsAg的磷酸根与氢氧化铝佐剂的氢氧根，这两个配基之间的交换，提供了最强的吸附机制。并且体内与体外的吸附度变化不大，所受到的解吸附作用极其微小。所以，当氢氧化铝佐剂成为纳米级颗粒时，由于比表面积急剧增加，纳米铝佐剂具有表面反应活性增高、表面活性中心增多、吸附能力增强等优异性质，可吸附更多的HBsAg抗原。所形成的新型乙肝疫苗表现出许多优点。此时铝佐剂的粒径成为了影响吸附度的主要因素。本专利技术发现，用本专利技术的纳米铝佐剂吸附的乙肝疫苗约为常规铝佐剂吸附的10-20倍。我们将本专利技术所指的新型乙肝疫苗免疫动物，并以市场销售的普通乙肝疫苗作为对照，观察动物体液免疫应答情况，纳米铝佐剂在初次免疫豚鼠后的第1周、第2周就可以产生抗-HBsAg抗体，其GMT分别为22.974±1.3612和26.389±1.4214，而市场销售的普通乙肝疫苗(添加常规铝佐剂)所对应的数值分别为2.0和13.195±1.1204。由于纳米颗粒的粒径小，不仅可以吸附更多的抗原蛋白，而且也易于被动物体内的抗原呈递细胞(APC)摄取，即新型乙肝疫苗表现出使动物接受初次免疫后的爆释效应(burst-released)。Raghuvanshi等人[Raghuvanshi RS，Katare YK，Komal Lalwani，et al.Improved immune response from biodegradable polymerparticles entraiepepng tetanus toxoid by use of different immunization protocol andadjuvants.International Journal of Pharmaceutics.2002，245109-121]也观察到该爆释效应。爆释效应是“抗原储存库”效应的快速释放。纳米佐剂更能快速有效的将病毒抗原呈递给APC细胞[Guy B，Pascal N，Francon A，et al.Design，characterization and preclinical efficacy of a cationic liiepd adjuvant for influenzasplit vaccine.Vaccine.2001；19(13-14)1794-1805]。目前商业用的铝佐剂主要为氢氧化铝和磷酸铝，但通常所指的铝佐剂主要是氢氧化铝，它实际上是A1(OH)3(aluminum hydroxide)分子内脱水的纤维状结晶态产物偏氢氧化铝(aluminum oxyhydroxide)，分子式为AlOOH。目前公认丹麦产的Alhydrogel为标准，其胶粒大小为3.07微米。铝佐剂的等电点pI(isoelectric point)＝11.4，在机体pH＝7.4的间质液中带正电荷，能很好的吸附酸性蛋白抗原的特点①使用时间长从1926年开始使用；②安全有效；③价廉；④广泛应用；⑤对某些疫苗辅佐效果弱或无佐剂活性；⑥易诱导IgE的表达；⑦注射部位偶有出现红斑、皮下结节、接触性过敏反应和肉芽肿性炎症等，甚至有的还出现比较严重的局部反应。
技术实现思路
本专利技术提供一种新型人用乙肝疫苗，其特征是，使用纳米铝佐剂材料，使市售的人用乙肝疫苗更多地被纳米铝佐剂所吸附，效果优于常规铝佐剂所吸附的传统的人用乙肝疫苗。本专利技术的新型人用乙肝疫苗可以在第一次免疫接种之后快速地产生应答，适合于紧急预防接种。新型人用乙肝疫苗还大大降低了副作用，注射疫苗部位的炎症性结节明显减少甚至根本没有。本专利技术是通过以下技术方案实现的，将氢氧化铝原料制成颗粒直径为1-999纳米的纳米级微粒、将此氢氧化铝微粒作为疫苗配方中铝佐剂的原料，优选的氢氧化铝颗粒粒度为1-400纳米，更优选的为1-100纳米，最优选的为72纳米。本专利技术通过电子显微镜方法测定氢氧化铝粒度，以得到合格的质量稳定的纳米级氢氧化铝颗粒。测定方法见本专利技术实施例。本专利技术的疫苗含有经过纯化的可作为疫苗应用的乙肝病毒灭活本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新型的人用乙肝疫苗，其特征在于，含有人用乙肝疫苗，和纳米铝佐剂，其配方比例为：乙肝病毒重组疫苗原料占２０－８０％；纳米铝佐剂占２０－８０％。

【技术特征摘要】
1.一种新型的人用乙肝疫苗，其特征在于，含有人用乙肝疫苗，和纳米铝佐剂，其配方比例为乙肝病毒重组疫苗原料占20-80％；纳米铝佐剂占20-80％。2.如权利要求1所述的乙肝疫苗，其特征在于，其配方比例为乙肝病毒重组疫苗原料占50％；纳米铝佐剂占50％。3.如权利要求1所述的乙肝疫苗，其特征在于，所述纳米铝佐剂的颗粒直径为1-999纳米。4.如权利要求1所述的乙肝疫苗，其特征在于，所述纳米铝佐剂的颗粒直径为1-400纳米。5.如权利要求1所述的乙肝疫苗，其特征在于，所述纳米铝佐剂的颗粒直径为1-100纳米。6.如权利要求1所述的乙肝疫苗，其特征在于，所述纳米铝佐剂的颗粒直径为平均粒经72纳米。7.如权利要求1所述的乙肝疫苗的制备方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕凤林，何萍，胡承香，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第三附属医院，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]