海带根中降血糖成分及其制备方法技术

本发明专利技术从海带根中提取、分离具有降血糖作用的有效部位及有效成分，海带根乙醇提取物用乙酸乙酯萃取得到有效部位，该部位不仅在体外试验中对α－葡萄糖苷酶和蛋白酪氨酸磷酸酯酶（ＰＴＰ１Ｂ）有抑制作用，而且在体内试验中具有显著的降糖尿病小鼠血糖作用，海带根副作用少且低，使得患者长期服用仍具有相当的安全性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及利用海带根制备降血糖药及其制备方法，尤其涉及采用现代提取、分离技术，从中药海带根中获得具有降血糖作用的有效部位及有效成分，制备降血糖药。
技术介绍
II型糖尿为一种常见病，病程迁延，并发症多且严重，难以根治，严重危害病人的健康。抗糖尿病药虽然很多，但尚无一种单一的、确切有效的一线药或可被推荐的标准治疗法。如盐酸二甲双胍等双胍类药物有胃肠道副作用；磺脲类药物有低血糖的不良反应；瑞格列奈、那格列奈等氯茴苯酸类药物的副作用为体重增加和严重低血糖；罗格列酮、吡格列酮等噻唑烷二酮和PPAR-γ类似物有肝损伤副作用；阿卡波糖、米格列醇等多糖类竞争性抑制剂，有胃肠道副作用；胰岛素替代药物比较安全有效，但是其价格非常昂贵。因此，需要研发疗效好，副作用少且小、标本兼治的降血糖中药现代制剂。α-葡萄糖苷酶在动物体内的主要作用是从碳水化合物的非还原端切下葡萄糖，当α-葡萄糖苷酶活性被抑制后，肠道葡萄糖的生成速度减缓，延缓或降低了餐后高血糖的出现，从而可达到防治糖尿病及其并发症发生的目的。蛋白酪氨酸磷酸酯酶(PTP1B)催化蛋白质酪氨酸去磷酸化反应。PTP1B通过对胰岛素受体激酶(Insulin receptor kinase，IRK)或IRK活性片段的磷酸化酪氨酸残基去磷酸化作用对胰岛素信号传导进行负调节，通过抑制PTPIB可增加胰岛素的活性。海带根为褐藻门植物海带Laminaria japonica的根状器，国内外尚未有其降血糖作用的报道。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是从海带根中分离具有降血糖作用的有效部位或有效成分，即海带根的乙酸乙酯提取物或从乙酸乙酯提取物中分离得到的成分。本专利技术的另一个目的是测定海带根有效部位对α-葡萄糖苷酶和蛋白酪氨酸磷酸酯酶(PTP1B)的抑制作用。本专利技术的又一个目的是测定海带根有效部位降糖尿病小鼠血糖的效果。本专利技术的第一方面，解决了上述中药有效部位的提取、分离方法，重现性好，能够用于工业生产。具体地，海带根药材主要用85％乙醇提取，得到提取浓缩物后用石油醚萃取去除其低极性成分，再用乙酸乙酯萃取得到有效部位。本专利技术的第二方面，以药材的活性为先导，对海带根降血糖有效部位和活性成分进行了追踪。实验从不同提取部位着手，选用α-葡萄糖苷酶和蛋白酪氨酸磷酸酯酶(PTP1B)为体外模型，进行抑制率和IC50的比较，初步确定海带根的有效部位为85％乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位。具体地，本专利技术研究了海带根有效部位体外对α-葡萄糖苷酶和蛋白酪氨酸磷酸酯酶(PTPlB)的抑制活性。这两种酶是糖尿病药物治疗中的重要靶点，有着成熟的活性检测方法(Kurihara H；M.Sasaki；M.Hatano.A new screening method for glucosidase inhibitors and itsapplication to algal extracts.Fisheries Science，1994，60759-761.Jacqueline M；Kathryn S；BrianK.Protein tyrosine phosphataseenzymatic assays.Methods，2005，352-8)，研究结果显示海带根乙酸乙酯部位在100～1000ug/ml浓度下对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率在20～90％，IC50为380ug/ml；对蛋白酪氨酸磷酸酯酶(PTP1B)的抑制率在30～90％，IC50为220ug/ml。本专利技术的第三方面，研究了海带根乙酸乙酯部位对糖尿病小鼠血糖的影响。具体地，昆明种小鼠60只，雄性，体重25±1g，腹腔注射链脲霉素诱发糖尿病模型。随机分组，每组10只。灌胃给药，每天一次，连续3天，末次给药后禁食不禁水2小时，眶内取血，用全自动生化仪测空腹血糖。表1数据表明海带根乙酸乙酯部位具有明显的降血糖作用，给药组与模型对照组差异极显著(P＜0.01)。并且实验中没有观察到毒、副作用。本专利技术的第四方面，建立了以II型糖尿病主要靶点为模型，进行体外高通量筛选降血糖药物的方法，这种方法简单快速，成本低，可实现快速的高通量筛选。具体地，本专利技术选用糖尿病的重要靶点α-葡萄糖苷酶和蛋白酪氨酸磷酸酯酶(PTP1B)为模型，进行药物的筛选和生物活性物质的追踪分离，得到有效部位或有效成分，然后进行小鼠体内的降血糖综合评价。表1 海带根有效部位对糖尿病小鼠血糖的影响(x±sd) 注P值模型组和正常对照组相比，各给药组和模型对照组相比。具体实施例方式实施例1 海带根降血糖有效部位的提取和分离取海带根药材17kg，用5倍量85％乙醇浸泡提取24-48h，其间超声波提取1-2h，过滤收集提取液；残渣用3倍量85％乙醇浸泡24-48h，其间超声波提取1-2h。合并两次提取液，0.09MPa，＜42℃浓缩得到浸膏850g，浸膏用少量水悬浮，用水饱和的石油醚萃取去除低极性成分，再用水饱和的乙酸乙酯萃取得有效部位9.80g，同时得到石油醚部位和水部位。对乙酸乙酯部位进行体外酶学实验测定，100～1000ug/ml浓度下对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率在20～90％，IC50为380ug/ml；对蛋白酪氨酸磷酸酯酶(PTP1B)的抑制率在30～90％，IC50为220ug/ml。而石油醚部位和水部位对两种酶均无抑制活性或者抑制活性很弱。实施例2 中药有效部位对α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定(1)配制溶液A(K3PO40.1mol/L，MgCl23.2mmol/L，PH6.8)和溶液B(K3PO40.5mol/L，MgCl216mmol/L，PH6.8)。(2)α-葡萄糖苷酶(Sigma，Type I，from bakers yeast)，以0.1unit/ml溶于溶液A；将底物p-Nitrophenyl α-D-Glucoside(Sigma)以6mmol/L溶于溶液A。(3)分别取1.02ml溶液B，2.82ml蒸馏水，2ml底物溶液，混合摇匀制得检测液，在96孔板上相应孔中各加入58.4ul检测液。(4)每孔加入12ul待测样品，设一重复作为背景，37℃水浴温育5min。(5)从水浴中取出96孔板，放在冰上，每孔加20ul酶液，背景加入20ul溶液A。(6)37℃水浴反应30min。(7)取出96孔板放在冰上，每孔加入120ul甘氨酸溶液(0.4mol/L，PH10.4)终止反应。(8)在酶标仪(microplate reader)测定405nm处吸光值A。(9)抑制率计算Inhibit rate＝(A-Ab)/Ac其中Ab为背景的吸光值，Ac为阴性对照的吸光值。实施例3 中药有效部位对蛋白酪氨酸磷酸酯酶(PTP1B)抑制活性的测定(1)配制stock buffer(50mM Hepes，1mM EDTA，1mM DTT，0.05％NP-40，PH7.2)和buffer A(100mM Hepes，1mM EDTA，PH7.0)，4℃保存。(2)将PTP1B(Sigma)用stock buffer稀释至2ug/ml，用buffer A溶解底物PNPP(Pierce)至17.6mM。(3)在96孔板相应孔中每孔加入170ul底物溶液。(4)每孔加入10ul样品，并设一本文档来自技高网...

【技术保护点】
海带根中一种降血糖的有效部位，其特征在于：主要由海带的根状器或根的乙酸乙酯提取物或萃取物组成。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：林秀坤，周通，胡朝欣，牛荣丽，王征，魏宁，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]