华蟾毒精的免疫调节新用途制造技术

通过ＭＴＴ法检测华蟾毒精单独作用及协同刀豆球蛋白Ａ或脂多糖作用对正常小鼠脾淋巴细胞增殖、转化的影响，通过ＭＴＴ法和中性红吞噬实验检测ＣＢＧ对腹腔巨噬细胞能量代谢水平及吞噬功能的影响；通过流式细胞术检测ＣＢＧ对正常小鼠脾淋巴细胞周期及脾中Ｔ淋巴细胞表面抗原ＣＤ４、ＣＤ８表达的影响。证实华蟾毒精具有免疫增强作用。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及华蟾毒精的免疫调节作用，属于医药领域范围。二、
技术介绍
华蟾毒精(Cinobufagin， CBG)是蟾蜍有效成分之一，化学名为: 5beta画Bufa-20，22-dienolide,14，15beta國epoxy-3beta，16beta-dihydroxy誦，16-acetate (8CI)。其结构如下具强心、升压、局部麻醉、抗肿瘤等作用，但其对机体免疫功能 的影响尚未见报道。本专利技术研究了华蟾毒精对小鼠免疫功能调节作用， 并初步阐明其免疫增强作用的机制，为寻找新的有效的中药免疫增强 剂提供一定的科学依据。三、
技术实现思路
通过MTT法检测CBG单独作用及协同刀豆球蛋白A (Con A)或脂 多糖(LPS)作用对正常小鼠脾淋巴细胞增殖、转化的影响，通过MTT法和中性红吞噬实验检测CBG对腹腔巨噬细胞(Peritoneal macrophage, PM①)能量代谢水平及吞噬功能的影响；通过流式细胞 术检测CBG对正常小鼠脾淋巴细胞周期及脾中T淋巴细胞表面抗原 CD4、 CD8表达的影响。四具体实施方式 1材料与方法 1. 1实验动物健康Balb/c小鼠，雄性S， 6-8周龄，体重(20土2) g，购于吉 林大学基础医学院实验动物中心，合格证号SCXK(吉2003-0001)。 1.2药品及试剂 1. 2. 1华蟾毒精来源华蟾毒精购自于中国生物制品检定所。 1. 2. 2试剂及配制华蟾毒精单体为脂溶性药物，配制时用匿S0 (终体积〈0. 1%)助 溶。刀豆球蛋白A (Con A Type IV)、脂多糖(LPS)、四甲基偶氮 噻唑蓝(MTT)、碘化丙啶(PI)、台盼蓝(TrypanBlue)均为Sigma 产品，RPMI-1640培养基(RPMI-1640完全培养基配制100 U mL—1 青霉素、100g'L链霉素、1%谷氨酰胺、10%灭活新生牛血清，pH 7.2)、胰蛋白酶均为Gibco产品，CD4/L3T4-PE、 CD8a/Lyt-2-FITC 荧光标记抗体均为Southern Biotech产品。 1.3 MTT法测定小鼠脾淋巴细胞转化率备成5乂106个.L的淋巴细胞悬液，每孔IOO pL加入96孔培养板，再每孔100 加入含不同浓度CBG的 RPMI-1640完全培养液，使终浓度分别为0.5、 1.0、 2.5、 5.0、 10、 15 mg'L(单药组)，或加入不同浓度CBG (0.5、 1.0、 2.5、 5.0、 10、 15 mg I/1)和ConA(5 mg L力或LPS(20 mg L力的混合液(组合 药物组)，同时设阳性、阴性和空白对照组，每组均设4复孔。37°C、 5% C02培养箱中连续培养44 h，每孔20 pL加入MTT液，继续培养 4h，用TECAN酶标仪(奥地利产品)于570nm处测定吸光度A，结 果以刺激指数(SI)反映小鼠脾淋巴细胞增殖、转化率的高低SI=药物刺激孔:i /阴性对照孔21.4小鼠腹腔巨噬细胞能量代谢水平及吞噬功能的测定制备、纯化小鼠PMO，计数细胞密度为5乂106个*1/，每孔100 PL加入96孔培养板，再每孔100 uL加入含不同浓度CBG的 RPMI-1640完全培养液，使终浓度分别为0.5、 2.5、 10 mg I/1 (单 药组)，或加入不同浓度的CBG(O. 5、2. 5、10mg C口 ConA(5 mg f1) 或LPS(20 mg'L)的混合液(组合药物组)，同时设阳性、阴性及 空白对照组，每组均设4复孔。37 。C、 5% C02培养箱中培养20 h， 每孔20 uL加入MTT，继续培养4h，于570 nm处测定吸光度。另 取PMd)，加药法同上，培养24h， 1800Xg离心10 min弃上清，每 孔IOO L加入中性红l g'L生理盐水液，继续培养30min; PBS 洗板2次，每孔IOO uL加入细胞溶解液(乙酸无水乙醇=1 : 1 K :O ，室温静置过夜并于540 nm处测定吸光度。1.5流式细胞术检测小鼠脾中T淋巴细胞表面标志无菌取小鼠脾，制备成5乂106个'L的淋巴细胞悬液，每孔1 mL 加入24孔培养板，再每孔lmL加入含不同浓度CBG的RPMI-1640完 全培养液，使终浓度分别为0.5、 2.5、 10 mg'L(单药组)，或加 入含不同终浓度CBG (0. 5、 2. 5、 10 mg I/1)和Con A (5 mg I/1) 或LPS (20 mg*L)的混合液(组合药物组)，并设阴性、阳性对 照组，每组均设3复孔。37°C、 5% C02培养箱中培养48 h，收集细 胞，CD4/L3T4-PE、 CD8a/Lyt_2-FITC荧光标记，上FACS Calibur型 流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司产品)检测T淋巴细胞表 面抗原。1.6流式细胞术检测小鼠脾淋巴细胞周期小鼠脾细胞悬液，处理同1.5，收集细胞，PI染色，上流式细 胞仪检测细胞周期。 1.7统计学处理所有数据输入计算机，用SPSS for windows 10. 0版本软件进行t 检验，计算结果以；± s表示。 2结果2.1华蟾毒精对小鼠脾淋巴细胞增殖、转化的影响如表1显示，CBG单药组及协同Con A或LPS药物组的SI值相对于阴性及阳性对照组均有一定提高，并呈一定量效关系，在一定 剂量时SI值达到高峰(代0.05或代0.01)，随着剂量的增加，其对 小鼠脾淋巴细胞转化的促进作用反而降低；其中协同LPS作用组对小鼠脾淋巴细胞增殖、转化的促进作用较其它两组明显。 表l.华蟾毒精对小鼠脾淋巴细胞转化率的影响<table>table see original document page 7</column></row><table>注1)阴性对照组，2) 5 m g LCon A阳性对照组，3) 20 m g-I^LPS阳性对照组。单药组同阴性对照组比较，组合组与阳性对 照组比较，4)代0.Q5， 5)代O.Ol，每组4复孔。2.2华蟾毒精对小鼠腹腔巨噬细胞的影响如表2-3显示，在O. 5、 2.5、 10mg L三个剂量下，CBG单药 组及协同Con A或LPS药物组对小鼠PM①代谢MTT及吞噬中性红能 力均有一定的促进作用(代0.05或代O.Ol)，并在2.5mg'L剂量时CBG的促进作用达到高峰，其中协同LPS作用组较其它两组明 显。表2.华蟾毒精对小鼠腹腔巨噬细胞能量代谢水平的影响<table>table see original document page 7</column></row><table>表3.华蟾毒精对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红能力的影响<table>table see original document page 8</column></row><table>注处理同表l。2.3华蟾毒精对小鼠脾淋巴细胞周期及T淋巴细胞表面标志的影 响如表4显示，在0.5、 2.5、 10mg*L—^1」量下，与阴本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有如下结构　＊＊＊　华蟾毒精的免疫调节作用。

【技术特征摘要】
1.一种具有如下结构华蟾毒精的免疫调节作用。2.如权利要求1所述的免疫调节作用，其特征在于增强机体脾淋巴...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋宇，邓旭明，王大成，
申请(专利权)人：宋宇，邓旭明，王大成，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]