本发明专利技术涉及用于鉴定治疗结核病之新药物的筛选方法，以及用于鉴定对这些新药物具有抗性之临床菌株的诊断方法。特别地，本发明专利技术涉及体外筛选通过干扰阿拉伯半乳聚糖生物合成来治疗结核病的候选药物的方法，所述方法包括如下步骤：将过表达使十聚异戊二烯磷酸核糖转化为十聚异戊二烯磷酸阿拉伯糖之蛋白质的结核分枝杆菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ?ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）细胞培养物与候选药物相接触，所述蛋白质可由ｒｖ３７９０基因或其同源物或者其基因产物与Ｒｖ３７９０蛋白相同或同源之任意人工开放读码框所编码，然后评价在测定试验（例如抗菌试验或酶促试验）中由候选药物所引起的相比于对照的抑制百分数。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于鉴定治疗结核病之新药物的筛选方法，以及鉴定对这些新药物具 有抗性之临床菌株的诊断方法。
技术介绍
结核病(tuberculosis，TB)仍是由单一感染性病原体结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis)引起的首要死因。该病原体已潜伏性感染了三分之一的世 界人口。目前，结核病化学疗法由一线和二线药物的混合剂构成。实际的结核病治疗需要 6 9个月，导致严重的毒性和抗药性。从引入抗结核病药物时开始便不断出现抗药性结核 分枝杆菌菌株。事实上，由于具有不寻常的细胞壁，分枝杆菌天然地对大多数常用抗生素具 有抗性。此外，认为遗传学改变也使其获得抗药性。由于结核分枝杆菌菌株对越来越多的 用于治疗多重抗药性结核病(multidrug-resistanttuberculosis，MDR-TB)的二线药物产 生抗性，因此其已成为世界范围公共健康的威胁(1)。因而，急需治疗结核病的新药物。特 别地，我们需要具有新作用机制的对抗药菌株具有活性的新药物。相应地，还存在鉴定新药 物靶标的迫切需求(2)。
技术实现思路
本专利技术基于以下发现，即来自结核分枝杆菌的蛋白质Rv3790(编码该蛋白质的 DNA 序列可以从 http://genolist. pasteur. fr/TubercuList (TubercuList 万维网服务器； Rv3790基因坐标从4162306到4163718)获得)是苯并噻嗪酮药物的靶标,苯并噻嗪酮 药物是一类新的对于治疗结核病很有前景的分子(“New thiazinone derivatives, their preparations andtheir use as antibacterials", # ^lJ Φ it ^ PCT/EP2006/004942, 申请人:Leibniz Institute for Natural Product Research and Infection Biology e. V. Hans- Knoll -Institute (HKI))。已显示Rv3790和Rv3791蛋白质协同作用并且参与阿拉伯半乳聚糖生物合成(3)。 阿拉伯半乳聚糖是分枝杆菌细胞壁的基本组分，其使分枝菌酸外层与肽聚糖共价结合。特 别是，Rv3790和Rv3791两者对于将十聚异戊二烯磷酸核糖转化为十聚异戊二烯磷酸阿拉 伯糖都很重要(3)。该发现提示，苯并噻嗪酮药物干扰分枝杆菌细胞壁的生物合成。值得注 意的是，通过H37Rv菌株中基于Himarl的转座子诱变发现rv3790_rv3791两种基因必不可 少⑷。我们发现Rv3790蛋白C端的突变及其过表达赋予结核分枝杆菌、牛分枝杆菌 (Mycobacterium bovis) BCG 和耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmetis)对苯并噻嗪酮衍 生药物的高度抗性。rv3790野生型和突变基因以及rv3791已被克隆并在大肠杆菌中过表 达。对苯并噻嗪酮衍生物敏感的Rv3790直向同源物已在下列属中发现诺卡氏菌属 (Nocardia)、红球菌属(Rhodococcus)禾口棒状杆菌属(Corynebacterium)0可以假定实验室评价苯并噻嗪酮衍生物得到的好结果与已发现的Rv3790抑制性 作用相关。这一证据能够促使针对Rv3790蛋白作用之药物的新研究。因此，Rv3790蛋白 和相关的同源物尤其是直向同源物不仅是苯并噻嗪酮类药物的最佳靶标，而且是发现可用 于对抗由结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌(Mycobacterium 1印rae)、诺卡氏菌、红球菌和棒状 杆菌引起之感染的新药物的有前景靶标。因此，本专利技术的一个目的是提供通过干扰阿拉伯半乳聚糖生物合成来治疗结核病 之候选药物的筛选方法，所述方法包括如下步骤将过表达使十聚异戊二烯磷酸核糖转化 为十聚异戊二烯磷酸阿拉伯糖之蛋白质的结核分枝杆菌细胞培养物与候选药物相接触，所 述蛋白质可由rv3790基因或其同源物或者其基因产物与Rv3790蛋白相同或同源之任意 人工开放读码框所编码，然后评价在测定试验中由候选药物所引起的相比于对照(仅用 PS0DIT-2载体转化的结核分枝杆菌)的抑制百分数。 优选地，所述测定试验是抗细菌活性的体外测定试验或酶促试验。本专利技术的另一目的是结核分枝杆菌突变株(第387位的氨基酸半胱氨酸被丝氨酸 或甘氨酸替换)的细胞培养制备物，其用作本专利技术方法中的对照工具。本专利技术的另一目的是制备用于酶活性测定和鉴定新药物之筛选方法的野生型和 突变型重组RV3790蛋白。突变基因编码的Rv3790型蛋白对干扰阿拉伯半乳聚糖生物合成之药物(例如苯 并噻嗪酮药物)具有抗性这一发现，对于诊断和治疗抗药性分枝杆菌菌株具有重要的启7J\ ο因此，本专利技术的另一目的是提供抗药性分枝杆菌菌株的快速诊断方法，其包括通 过聚合酶链式反应(5)扩增从结核病患者中分离的结核分枝杆菌菌株rv3790基因的内部 区域(其覆盖第387位密码子)，以及分析DNA序列中是否存在对干扰阿拉伯半乳聚糖生物 合成之药物(如苯并噻嗪酮)具有抗性的经鉴定突变。在本专利技术的上下文中，术语“干扰阿拉伯半乳聚糖生物合成的药物”是指通过阻断 或沉默使十聚异戊二烯磷酸核糖转化为十聚异戊二烯磷酸阿拉伯糖的蛋白质来阻止十聚 异戊二烯磷酸核糖转化为十聚异戊二烯磷酸阿拉伯糖的分子，所述蛋白质可由rv3790基 因或其同源物或者其基因产物与Rv3790蛋白相同或同源之任意人工开放读码框所编码。本专利技术的另一目的是通过本专利技术筛选方法获得的Rv3790蛋白的抑制剂，以及通 过使用这样的抑制剂治疗结核病的方法，其中这样的抑制剂优选地选自苯并噻嗪酮(或代 谢产生苯并噻嗪酮的其它分子)、抗Rv3790的单克隆抗体、反义RNA序列或疫苗。附图说明图1显示来自放线菌若干属的Rv3790直向同源物的多序列比对分析；图2显示rv3790基因的DNA序列。专利技术详述本专利技术的第一目的是筛选通过干扰阿拉伯半乳聚糖生物合成来治疗结核病之候 选药物的方法，所述方法包括将过表达使十聚异戊二烯磷酸核糖转化为十聚异戊二烯磷酸 阿拉伯糖之蛋白质的结核分枝杆菌细胞培养物(用pS0DIT-2/Rv3790转化)与候选药物相 接触，所述蛋白质可由rv3790基因或其同源物或者其基因产物与Rv3790蛋白相同或同源之任意人工开放读码框所编码，然后评价在测定试验中由候选药物所引起的相比于对照的 抑制百分数。优选地，所述测定试验是抗细菌活性的体外试验或酶促试验。在抗细菌试验中，抑制百分数的评价优选通过测定最低抑制浓度(Minimum Inhibitory Concentration, MIC)来进行。MIC定义为经适当孵育后抑制微生物可见生长 的抗微生物剂的最低浓度。还利用仅转化pS0DIT-2载体的结核分枝杆菌细胞培养物来测试每种候选药物。作为对照，可使用异烟胼，其是治疗结核病的参照药物。 作为替代或另外地，可以进行不同的对照实验，其中不使用任何候选药物进行治 疗，从而得到0%的抑制。评价候选药物相对于这种对照的抑制百分数。所述将结核分枝杆菌细胞培养物与候选药物相接触的步骤可以通过将细胞制备 物置于适当培养基中具有不同药物浓度的一种或多种候选本文档来自技高网...
【技术保护点】
体外筛选通过干扰阿拉伯半乳聚糖生物合成来治疗结核病之候选药物的方法，所述方法包括将过表达使十聚异戊二烯磷酸核糖转化为十聚异戊二烯磷酸阿拉伯糖之蛋白质的结核分枝杆菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）细胞培养物与候选药物相接触，所述蛋白质可由ｒｖ３７９０基因或其同源物或者其基因产物与Ｒｖ３７９０蛋白相同或同源之任意人工开放读码框所编码，然后评价在测定试验中由所述候选药物所引起的相比于对照的抑制百分数。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
【专利技术属性】
技术研发人员：焦万纳里卡尔迪，朱莉娅马尼纳，玛丽亚罗萨莉娅帕斯卡，
申请(专利权)人：森迪奈尔CH有限责任公司，
类型：发明
国别省市：IT[意大利]
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