使用合成的聚合物递送对基因沉默有活性的核酸的工具制造技术

本发明专利技术涉及可用作转染剂的组合物，所述组合物含被芳香族氨基酸修饰的聚胺和用于ＲＮＡ干扰的小双链或单链ＲＮＡ。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用合成的聚合物递送对基因沉默有活性的核酸的工具本专利技术涉及在细胞中介导基因沉默的核酸、特别是提供RNA干扰(RNAi)的小干扰RNA(在后面的说明书和权利要求书中被称为siRNA)、以及任选质粒DNA的有效的合成的聚合物介导的体内或离体递送至培养中的真核细胞的工具、组合物和方法。RNA干扰(RNAi)是一种用于在早期基因功能水平基因沉默mRNA的技术(Fireetal，1998)。其原理是短RNA双链体(siRNA；小干扰RNA)极端选择性干扰mRNA中的一个靶，使提供序列特异性的mRNA降解从而抑制蛋白质产生。RNAi的高效缘于对siRNA有活性的序列的可预测设计以及对mRNA的靶向性。在许多种哺乳动物细胞中，包括细胞系(Elbashiretal，2001)及原代细胞中，当siRNA双链体通过载体、转染剂转染被导入，且被递送到细胞质内时，RNAi就已经显示出有效的内源性及外源性基因沉默。RNAi对于人治疗是很强大的工具，它将引人注目地带来严重疾病(如癌症或病毒感染)的新治疗方法上的进展。对于开发RNAi的巨大潜能，需要RNAi转染载体的构建和开发用于有效地将其递送到患病有机体的细胞和组织中的策略。RNAi的成功取决于siRNA(设计和化学作用)和用于细胞递送的载体/载质。相比反义或核酶技术，靶mRNA的二级结构(也许不是)对使用siRNA进行沉默并不是强限制因素。多个siRNA序列可能对一个靶向mRNA有效。siRNA双链体的稳定性和递送到细胞的siRNA的量是对沉默最大的限制因素，而非所选序列的靶向接近性。有两个方法被提供用来将siRNA导入细胞：用合成的siRNA双链体转染入细胞的细胞质中来递送；以及由质粒(或DNA盒)原位表达通过基因转移至细胞核而初步导入的siRNA的递送。RNAi在哺乳动物细胞中依赖于以下二者的有效的细胞内递送：siRNA或者表达si/shRNA或适合于微RNA的短发夹RNA(shRNAmir)的DNA载体(Suietal.，2002；Yuetal.，2002；Miyagishi&Taira，2002；Silvaetal.，2005；Brummelkampetal.，2002)。ShRNA(短发夹RNA)或siRNA在哺乳动物细胞中的表达可经由PolII或PolIII(U6或H1)启动子的转录实现。DNA载体基于表达双链短发夹RNA(shRNA)的质粒和病毒载体系统，所述shRNA随后被细胞器加工为siRNA。ShRNA系统的新进展允许了组织特异性且可诱导的基因敲除。这种表达对RNA干扰有活性的RNA的DNA载体的细胞内递送可使用重组病毒或非病毒递送系统实现。说到基因导入技术，有效的病毒或非病毒载体对细胞中siRNA双链体的导入是有用的。对培养中的哺乳动物细胞来说，因为病毒载体的转染效率和易于将DNA递送入细胞核，其表现为对由递送的质粒DNA表达的siRNA的细胞内库的产生的有力手段。但是，重组病毒递送系统仍然遭受来自它们临床表现中的免疫原性和潜在风险。相反，用合成系统的核酸(质粒或合成的siRNA)转染则是显示了灵活性和不出现免疫原性的多用途方法。用非病毒载体转染合成的siRNA双链体(化学法产生的或酶法产生的)是主要将短双链RNA递送入细胞质的最好技术。对siRNA递送最有效的非病毒载体基于阳离子脂质介导的转染，它最初来自基因递送领域或最近开发用于特异性RNAi应用。阳离子脂质制剂将核酸(质粒、寡核苷酸类、siRNA双链体)包装入带正电的颗粒中，所述颗粒能在细胞表面与阴离子蛋白聚糖类相互作用，并由胞吞作用进入细胞。在运送到胞吞胞内囊泡(主要是胞内体)后，阳离子脂质具有通过脂质交换/扩散使这些胞内小室的膜去稳定的特性，从而导致核酸“去复合”并释放到细胞质(XuandSzoka，1996)。另外，被称为质子海绵活性的第二机制可与一些脂质诱导胞内体膨胀和破裂(其将核酸释放到细胞质中)相关。由于RNAi机制出现在细胞质中，基于阳离子脂质制剂的载体是将合成的siRNA双链体递送到细胞中的有效媒质。由质粒、非病毒载体原位表达的siRNA，基于阳离子脂质制剂或阳离子聚合物，使胞内体小室去稳定是适宜的。与它们能够有效地将基因(长的双链DNA)转染到细胞内相反，阳离子聚合物对递送短的核酸缺乏效率。阳离子聚合物显示出比基于阳离子脂质的系统缺少递送siRNA的效率。阳离子聚合物能够体外介导siRNA浓度约100～200nM的RNA干扰。这种浓度下RNA干扰的选择性是它们使用上的限制。此外，所用siRNA的高量与诱导细胞毒性效应的聚合物高量相关联。迄今为止，体外使用了阳离子聚合物(如分枝的或线性的聚乙烯亚胺、聚组氨酰聚合物、壳聚糖、聚(氨基酯乙二醇氨基甲酸乙酯)、氨基环糊精衍生物)，但未与阳离子脂质比较相关效率。本专利技术的目的是提高阳离子聚合物、此非病毒性递送载体的主要种类对体外siRNA转染的能力。阳离子聚合物能够经siRNA的磷酸与聚合物的氨基间的静电相互作用而相互作用。但依照siRNA的结构，聚合物不能缩合包含仅两个圈(每链约20个核苷酸)的如此小的双螺旋。甚至复合物出现在siRNA和阳离子聚合物之间，导致siRNA附着在聚胺主干上，阳离子聚合物缺乏协同相互作用来引发缩合入复合分子的颗粒或微-聚集物。除聚胺和小双链寡核苷酸携带的正负电荷间的静电相互作用之外，与核酸碱基的疏水堆积和氢键形成相互作用是我们旨在增大聚胺和siRNA之间相互作用的方法。总之，静电和疏水相互作用以及氢键提供足够能量导致siRNA的稳定复合和缩合作用。芳香族氨基酸(AAA)负责蛋白质的疏水特性并且还与蛋白质之间以及蛋白质-配体间经由疏水相互作用的相互作用有关。AAA还能够与核酸通过与核酸碱基(鸟嘌呤，腺嘌呤，胸腺嘧啶或胞嘧啶)堆积来相互作用。本专利技术涉及疏水性聚胺的新概念，所述疏水性聚胺包含被芳香族氨基酸高度修饰的聚胺主干。此类聚合物提供了与小核酸(如siRNA)经由静电作用、疏水性堆积以及氢键而相互作用的可能性。作为待克服能量壁垒，通过将AAA化学连接到聚胺的增加将能够提供足够的能量去诱导以缩合结束的协同相互作用。结果是由疏水相互作用产生的复合物的稳定化(以稳定颗粒或聚集物形式)。本专利技术描述了新类的非病毒转染剂，其属于阳离子聚合物类，尤其适合应用于小尺寸寡核苷酸的转染。特别是小核苷酸的物理性质提示了本专利技术人去设计基于疏水性和阳离子聚合物的新类转染剂。本专利技术人已发现，高效的转染剂可通过组合目的寡核苷酸与疏水性及阳离子聚合物形成稳定的转染复合物来获得。有益的是、所述制剂也可用于siRNA与质粒DNA的共转染，其可促进介导RNA干扰的小RNA的原位表达。本专利技术还旨在提供用作用于siRNA和表达对RNAi有活性的RNA的任选DNA载体的转染剂的新组合物。本专利技术还涉及体外转染细胞的方法。用作转染剂的本专利技术的组合物含：经芳香族氨基酸修饰的聚胺和小的双链或单链RNA。有益的是、聚胺包括分枝或线性的聚乙烯亚胺、聚烯丙胺、树状聚体、聚氨酯、聚赖氨酸、聚组氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸或壳聚糖。所述聚胺更尤其选自：线性的聚乙烯亚胺(LPEI)、聚烯丙胺(PAA)和聚赖氨酸(PLL)。所述聚胺的分子量优选400Da以上。有本文档来自技高网...

【技术保护点】
用作转染剂的组合物，其含：经芳香族氨基酸修饰的聚胺和对ＲＮＡ干扰有活性的双链或单链ＲＮＡ。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2007-12-13 61/013,3581.用作转染剂的组合物，其含：●聚胺，其选自移接了15％～50％的酪氨酸和/或色氨酸的线性的聚乙烯亚胺或聚烯丙胺、和●对RNA干扰有活性的双链小RNA或单链小RNA。2.权利要求1的组合物，其中所述聚胺的分子量为400Da以上。3.权利要求1的组合物，其中所述聚胺选自：线性的2KD～220KD的聚乙烯亚胺和线性的10KD～70KD的聚烯丙胺。4.权利要求1的组合物，其中所述RNA是普通或经修饰的RNA，修饰基团为：2’-氟基、2’-甲氧基、硫代磷酸基、锁核酸或吗啉基。5.权利要求1的组合物，其中所述RNA是双链或单链反义siRNA，或者单链正义/反义siRNA的混合物。6.权利要求5的组合物，其中所述siRNA是15～30聚体。7.权利要求1的组合物，其含：●聚胺，其选自移接了移接了15％～50％的酪氨酸和/或色氨酸的线性的聚乙烯亚胺或聚烯丙胺、和●等渗介质中的双链siRNA或单链...

【专利技术属性】
技术研发人员：A阿迪布，P埃尔巴彻，F斯多克，N哈夫迪，
申请(专利权)人：聚加转染公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]