用于自动预处理糖链的仪器制造技术

本发明专利技术提供用于分析生物样品特别是血清中含有的糖链的自动分析仪器。即，旨在提供分析样品中的糖链的方法，所述方法包括下列步骤：Ａ）释放样品中的糖链的糖链释放步骤；Ｂ）制备用于检测的释放的糖链的检测样品制备步骤；和在利用板子进行质谱测试的情况下，Ｃ）形成具有点样于其上的捕获的糖链的用于质谱测试的板子的步骤，该步骤包括在收集板子上提供步骤Ｂ）中得到的标记的糖链样品溶液的步骤；和，如果需要，在附着有固相支持体的板子中进行操作以形成用于质谱测试的板子的步骤；和Ｄ）分析待测试的糖链的步骤。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于糖链分析的仪器。本专利技术可应用于疾病的诊断等。更具体地讲， 本专利技术涉及自动糖链预处理仪器。
技术介绍
用于定量分析糖链的预处理方法(专利文件1 ；非专利文件1)。已报道了一种高 灵敏度地迅速检测糖链的方法以便快速分析糖链，该方法如下进行选择性地仅捕获从糖 蛋白释放的糖链，将糖链固定在珠子上，并洗涤该珠子(非专利文件2)。然而，使用大量样 品例如血清样品自动完成糖链分析的仪器或预处理仪器仍是未知的。在常规技术中，体液例如血(清)和细胞/组织提取物的生物学衍生的混合物中 含有的糖链的纯化是按照下列步骤完成的。A.在可溶产物存在下将样品中的糖蛋白还原烷基化。B.将蛋白水解酶加入其中以便用该酶消化蛋白质部分，然后将系统加热来灭活所 述酶。C.进行从肽释放糖链的酶处理或化学处理来释放糖链。D.使具有能捕获糖链的官能团的聚合物珠子(polymer beads)与已经用C.项处 理的样品接触，并由此通过聚合物珠子的官能团来捕获释放的糖链。E.将样品洗涤并过滤以便除去那些未被聚合物珠子的官能团捕获的杂质。F.通过甲基酯化官能团来保护被聚合物珠子的官能团捕获的糖链的唾液酸残基 的羧酸。G.将聚合物珠子的官能团捕获的糖链进行腙键还原，以稳定其与聚合物珠子的结I=I OH.通过腙-肟交换反应、通过裂解珠子上的糖链捕获分子中包含的二硫键或者通 过给予含氨基氧基的化合物，从聚合物珠子释放糖链。在后者情况中，不进行G.项处理。I.在滤液中回收释放的糖链。J.将MALDI基质加入含有糖链的滤液中，然后将混合物滴加在MALDI板上。专利文件1 :W0 2004/058687非专利文件1 :Mol. Cell. Proteomics. 2007 ；6 :1437_45。基于释放N-聚糖的标准 化方法的人全血清糖蛋白的定量糖组学(Quantitativeglycomics of human whole serum glycoproteins based on the standardizedprotocol for liberating N-glycans). Kita Y, Miura Y, Furukawa J, NakanoM,Shinohara Y, Ohno M, Takimoto A, Nishimura S。非专利文件2 =Chem. Euro. J. 2007 ；13 :4797_804。用于通过质谱法的定量糖组学 的唾液酸残基快速而简单的固相酯化(Rapid and simplesolid-phase esterification of sialic acid residues for quantitative glycomicsby mass spectrometry). Miura Y, Shinohara Y, Furukawa J, Nagahori N, Nishimura S。
技术实现思路
本专利技术要解决的问题然而，上述过程通常主要通过手动来完成，因此，这些过程需要大量的时间和劳 动，而且实现高度准确的纯化是困难的。在这种情况下完成了本专利技术，且本专利技术旨在提供自动糖链预处理仪器，该仪器通 过使处理过程自动化而使得纯化快速高准确度地完成。也就是说，本专利技术的目的是提供用于分析血清样品中含有的糖链的自动分析仪 器。一个目的是使利用自动分析仪器同时自动分析大量的样品成为可能。为了从糖蛋白定 量释放糖链，需要繁琐的预处理例如应用增溶剂、还原烷基化和经胰蛋白酶消化。另外，可 以将已定量释放的糖链通过进行化学选择性捕获并藉此容易地除去不受欢迎的异物而实 现糖链的快速分析。然而，一次处理多个测试样品是困难的。因此，意欲优化上述的各个过 程并建立适合于自动分析的系统。解决问题的方法本专利技术的专利技术人进行了详细的研究，由此，他们发现了当应用血清样品时，能自动 制备用于质谱法的样品的仪器。其后，通过进行质谱法分析，使糖链的自动分析成为可能。 本专利技术人已能够研制可以完成包括从预处理到糖链的捕获、唾液酸的修饰以及至糖链释放 的全部过程的仪器。本专利技术提供以下内容。(1)用于分析样品中的糖链的方法，该方法包括下列步骤A)释放样品中的糖链的糖链释放步骤，该步骤包括下列步骤A-1)将样品提供在用于反应的板子上的步骤；A-2)添加增溶剂到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤；A-3)添加还原剂到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤；A-4)添加-SH保护剂到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤；A-5)添加蛋白水解酶到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤；A-6)灭活蛋白水解酶的步骤；和A-7)添加糖链释放酶到样品中从而释放糖链的步骤；B)制备用于在检测中使用的释放的糖链的检测样品制备步骤，该步骤包括下列步 骤B-1)使步骤(A)中制备的样品与糖链捕获珠子接触，然后将样品置于使样品中释 放的糖链结合至所述珠子的条件下，并由此产生捕获的糖链样品的步骤；B-2)添加蛋白变性剂到捕获的糖链样品中然后将捕获的糖链样品置于反应条件 下的步骤；B-3)洗涤捕获的糖链样品，然后通过抽吸(suction)除去残留的洗涤液体的步 骤；B-4)添加珠子上的糖链捕获剂的盐释放剂到捕获的糖链样品中，然后通过抽吸除 去盐释放剂的步骤；B-5)添加保护剂到捕获的糖链样品中然后将捕获的糖链置于反应条件下的步 骤；B-6)添加酸到捕获的糖链样品中，并通过抽吸除去该酸的步骤；B-7)添加有机反应溶剂到捕获的糖链样品中的步骤；B-8)除去珠子中的水分和溶剂的步骤；B-9)添加烷基酯化剂到捕获的糖链样品中然后将捕获的糖链样品置于反应条件 下，并将唾液酸的羧酸烷基化的步骤；B-10)添加有机反应溶剂到捕获的糖链样品中，并通过抽吸除去有机反应溶剂的 步骤；B-11)洗涤捕获的糖链样品，然后通过抽吸除去残留的洗涤液体的步骤；B-12)从捕获的糖链样品中释放糖链样品的步骤，其中当进行分析所需要的标记 时，将捕获的糖链样品中的糖链用标记试剂标记并将其从珠子释放；和B-13)溶解释放的糖链样品以产生糖链样品溶液的步骤；C)当使用板子进行质谱法分析时，制备具有点样(dotted)于其上的捕获的糖链 样品的用于质谱测试的板子的步骤，该步骤包括C-1)在用于回收的板子上处理步骤⑶中得到的标记的糖链样品溶液的步骤；并 且该步骤还任选包括步骤(C-2)至(C-6)C-2)在用于混合的板子上处理来自用于回收的板子上的标记的糖链样品溶液和 有机溶剂以得到糖链吸附至固相的在有机溶剂中的浓度的步骤；C-3)提供附着有固相载体的板子的步骤；C-4)根据附着有固相载体的板子的相，活化附着有固相载体的板子并洗涤该附着 有固相载体的板子的步骤；C-5)添加标记的糖链样品溶液至附着有固相载体的板子，并使标记的糖链样品溶 液顺应具有适合于附着有固相载体的板子的相的极性的溶剂的步骤；C-6)通过抽吸从附着有固相载体的板子回收标记的糖链样品溶液至第二个用于 回收的板子的步骤；和当将标记的糖链样品溶液进行MALDI-TOF MS时，包括下列步骤(C_7)C-7)将标记的糖链样品溶液与用于质谱测试的基质混合，并将该混合物点样于用 于测试的板子上的步骤；和D)对待测试的糖链进行分析的步骤。(2)根据第(1)项的方本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于分析样品中的糖链的方法，该方法包括下列步骤：Ａ）释放样品中的糖链的糖链释放步骤，该步骤包括下列步骤：Ａ－１）将样品提供在用于反应的板子上的步骤；Ａ－２）添加增溶剂到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤；Ａ－３）添加还原剂到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤；Ａ－４）添加－ＳＨ保护剂到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤；Ａ－５）添加蛋白水解酶到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤；Ａ－６）灭活蛋白水解酶的步骤；和Ａ－７）添加糖链释放酶到样品中从而释放糖链的步骤；Ｂ）制备记的糖链样品溶液与用于质谱测试的基质混合，并将该混合物点样于用于测试的板子上的步骤；和Ｄ）对待测试的糖链进行分析的步骤。在检测中使用的释放的糖链的检测样品制备步骤，该步骤包括下列步骤：Ｂ－１）使步骤（Ａ）中制备的样品与糖链捕获珠子接触，然后将样品置于使样品中释放的糖链结合至所述珠子的条件下，并由此产生捕获的糖链样品的步骤；Ｂ－２）添加蛋白变性剂到捕获的糖链样品中然后将捕获的糖链样品置于反应条件下的步骤；Ｂ－３）洗涤捕获的糖链样品，然后通过抽吸除去残留的洗涤液体的步骤；Ｂ－４）添加珠子上的糖链捕获剂的盐释放剂到捕获的糖链样品中，然后通过抽吸除去盐释放剂的步骤；Ｂ－５）添加保护剂到捕获的糖链样品中然后将捕获的糖链样品置于反应条件下的步骤；Ｂ－６）添加酸到捕获的糖链样品中，并通过抽吸除去酸的步骤；Ｂ－７）添加有机反应溶剂到捕获的糖链样品中的步骤；Ｂ－８）除去珠子中的溶剂和水分的步骤；Ｂ－９）添加烷基酯化剂到捕获的糖链样品中然后将捕获的糖链样品置于反应条件下，并将唾液酸的羧酸烷基化的步骤；Ｂ－１０）添加有机反应溶剂到捕获的糖链样品中，并通过抽吸除去有机反应溶剂的步骤；Ｂ－１１）洗涤捕获的糖链样品，然后通过抽吸除去残留的洗涤液体的步骤；Ｂ－１２）从捕获的糖链样品中释放糖链样品的步骤，其中当进行分析所需要的标记时，将捕获的糖链样品中的糖链用标记试剂标记并将其从珠子释放；和Ｂ－１３）溶解释放的糖链样品以产生糖链样品溶液的步骤；Ｃ）当使用板子进行质谱法分析时，制备具有点样于其上的捕获的糖链样品的用于质谱测试的板子的步骤，该步骤包括：Ｃ－１）在用于回收的板子上处理步骤（Ｂ）中得到的标记的糖链样品溶液的步骤；并且该步骤还任选包括步骤（Ｃ－２）至（Ｃ－６）：Ｃ－２）在用于混合的板子上处理来自用于回收的板子上的标记的糖链样品溶液和有机溶剂以得到糖链吸附至固相的在有...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】JP 2007-10-5 262680/2007;JP 2007-10-5 262771/2007用于分析样品中的糖链的方法，该方法包括下列步骤A)释放样品中的糖链的糖链释放步骤，该步骤包括下列步骤A-1)将样品提供在用于反应的板子上的步骤；A-2)添加增溶剂到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤；A-3)添加还原剂到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤；A-4)添加-SH保护剂到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤；A-5)添加蛋白水解酶到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤；A-6)灭活蛋白水解酶的步骤；和A-7)添加糖链释放酶到样品中从而释放糖链的步骤；B)制备在检测中使用的释放的糖链的检测样品制备步骤，该步骤包括下列步骤B-1)使步骤(A)中制备的样品与糖链捕获珠子接触，然后将样品置于使样品中释放的糖链结合至所述珠子的条件下，并由此产生捕获的糖链样品的步骤；B-2)添加蛋白变性剂到捕获的糖链样品中然后将捕获的糖链样品置于反应条件下的步骤；B-3)洗涤捕获的糖链样品，然后通过抽吸除去残留的洗涤液体的步骤；B-4)添加珠子上的糖链捕获剂的盐释放剂到捕获的糖链样品中，然后通过抽吸除去盐释放剂的步骤；B-5)添加保护剂到捕获的糖链样品中然后将捕获的糖链样品置于反应条件下的步骤；B-6)添加酸到捕获的糖链样品中，并通过抽吸除去酸的步骤；B-7)添加有机反应溶剂到捕获的糖链样品中的步骤；B-8)除去珠子中的溶剂和水分的步骤；B-9)添加烷基酯化剂到捕获的糖链样品中然后将捕获的糖链样品置于反应条件下，并将唾液酸的羧酸烷基化的步骤；B-10)添加有机反应溶剂到捕获的糖链样品中，并通过抽吸除去有机反应溶剂的步骤；B-11)洗涤捕获的糖链样品，然后通过抽吸除去残留的洗涤液体的步骤；B-12)从捕获的糖链样品中释放糖链样品的步骤，其中当进行分析所需要的标记时，将捕获的糖链样品中的糖链用标记试剂标记并将其从珠子释放；和B-13)溶解释放的糖链样品以产生糖链样品溶液的步骤；C)当使用板子进行质谱法分析时，制备具有点样于其上的捕获的糖链样品的用于质谱测试的板子的步骤，该步骤包括C-1)在用于回收的板子上处理步骤(B)中得到的标记的糖链样品溶液的步骤；并且该步骤还任选包括步骤(C-2)至(C-6)C-2)在用于混合的板子上处理来自用于回收的板子上的标记的糖链样品溶液和有机溶剂以得到糖链吸附至固相的在有机溶剂中的浓度的步骤；C-3)提供附着有固相载体的板子的步骤；C-4)根据附着有固相载体的板子的相，活化附着有固相载体的板子并洗涤该附着有固相载体的板子的步骤；C-5)添加标记的糖链样品溶液至附着有固相载体的板子，并使标记的糖链样品溶液顺应具有适合于附着有固相载体的板子的相的极性的溶剂的步骤；C-6)通过抽吸从附着有固相载体的板子回收标记的糖链样品溶液至第二个用于回收的板子的步骤；和当将标记的糖链样品溶液进行MALDI-TOF MS时，包括下列步骤(C-7)C-7)将标记的糖链样品溶液与用于质谱测试的基质混合，并将该混合物点样于用于测试的板子上的步骤；和D)对待测试的糖链进行分析的步骤。2.根据权利要求1的方法，其中前述的步骤与至少任何一种下面的情况相关 A)在释放样品中的糖链以制备用于分析的糖链样品的糖链释放步骤中 A-1)样品是体液、细胞提取物或组织提取物；A-2)增溶剂是1-丙磺酸、2-羟基-3-月桂酰胺(PHL)、1-丙磺酸、2-羟基-3-肉豆蔻 酰胺(PHM)、2-羟基-3-磺丙基月桂酸酯(HSD)或其等价物，且 反应条件是在25°C-42°C下；A-3)还原剂是二硫苏糖醇(DTT)、TCEP (三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液，0. 5M)或其 等价物，且反应条件是在室温至80°C下；A-4)-SH保护剂是碘乙酰胺(IAA)或其等价物，且反应条件是在黑暗中于20-37°C下；A-5)蛋白水解酶是胰蛋白酶、糜蛋白酶或其等价物，且反应条件是在25-42 °C下；A-6)用于灭活的条件包括加热至65°C或更高；A-7)糖链释放酶是肽-N-糖苷酶F、肽-N4-(乙酰基-β -葡糖胺基)-天冬酰胺酰胺 酶(PNGaseF)、Endo H或其等价物，且用于糖链释放酶的反应条件是在25°C -42°C下； 就步骤(B)而言，B-1)珠子是具有糖链捕获基团的珠子或磁性珠子，所述糖链捕获基团包括氨基氧基基 团、N-烷基氨基氧基基团、酰胼基团、叠氮基团、氨基硫脲基团、半胱氨酸残基或与其结合的 衍生物，且样品中释放的糖链结合至珠子的条件是在25-80°C下；B-2)变性剂是盐酸胍、脲、十二烷基硫酸钠或其等价物，且反应条件包括在室温添加、并保持该温度以使珠子充分膨胀(10秒至5分钟)；B-3)洗涤用水进行；B-4)珠子上的糖链捕获剂是氨基氧基基团、N-烷基氨基氧基基团、酰胼基团、叠氮基 团、氨基硫脲基团、半胱氨酸残基或其衍生物，且在酰胼情况下，盐释放剂是三乙胺或其等 价物，及在N-烷基氨基氧基基团情况下，盐释放剂是三乙胺或其等价物； B-5)保护剂是乙酸酐、琥珀酸酐或其它酸酐或其等价物，且 反应条件是在15-37°C使用乙酸酐/甲醇； B-6)酸是盐酸或另外的无机酸或pH 2-3的等价酸；B-7)所述步骤包括在用有机反应溶剂置换之前用亲水性有机溶剂置换的步骤，并且亲水性有机溶剂是低级醇例如甲醇或乙醇、乙腈或丙酮，而有机反应溶剂是二氧六环、乙腈、 四氢呋喃或其等价物；B-8)除去珠子中的溶剂和水分的步骤包括用滤纸、吸墨纸、纱布、毛巾、手帕、薄纸或棉 布擦拭底部；B-9)烷基酯化剂是甲基-对-甲苯基-三氮烯(MTT)、乙基-对-甲苯基-三氮烯 (ETT)、丁基-对-甲苯基-三氮烯(BTT)或其等价物，且反应条件是在20-80°C使用IOOmM MTT/ 二氧六环，持续30分钟至5小时； B-10)有机反应溶剂是二氧六环、乙腈、四氢呋喃或其等价物； B-11)洗涤用甲醇、NaCl溶液和水中的至少一种进行；B-12)进行标记，所述标记采用能吸收紫外线和可见光的生色团、具有发射荧光的结构 的标记物、具有能与另一个分子相互作用的分子的亲和标记物、具有能与官能团特异性反 应的官能团的标记物、具有在疏水结构中的官能团的标记物或者具有金属离子配体的标记 物来进行，并且标记通过添加乙酸、乙腈、醋酸盐缓冲液或其等价物来进行，和 B-13)标记的捕获的糖链样品的溶解采用水、水溶液或其等价物来完成；C)在制备具有点样于其上的捕获的糖链样品的用于质谱测试的板子的步骤中； C-1)用于回收的板子上的处理在除去标记试剂的条件下进行；C-2)糖链吸附至固相的浓度是80-90%在有机溶剂中；C-3)附着有固相载体的板子是多孔型的并包含适合于固相萃取的树脂或膜的表面； C-4)当附着有固相载体的板子是正相模式时，洗涤依次用水和乙腈进行，并且当附着 有固相载体的板子是反相模式时，洗涤依次用低级醇例如甲醇和水进行；C-5)在正相模式情况下具有相反极性的溶剂是疏水有机溶剂，并且，在反相模式中具 有相反极性的溶剂是亲水溶剂。C-6)第二个用于回收的板子是多孔型的并包含适用于固相萃取的树脂或膜的表面；和C-7)用于质谱测试的基质是2，5_ 二羟基苯甲酸或其等价物，并且在用于质谱测试的 基质上的标记的糖链样品溶液的点样混合或依次进行，并将其任选地稀释；D)通过高效液相色谱(HPLC)、液相色谱-电喷雾电离质谱(LC-ESIMS)、基质辅助的激 光解吸电离-飞行时间(MALDI-T0F)或其等价方法进行待测定糖链的分析，然而当在标记 中使用着色剂或生物素时，根据需要进行除去任何过量的着色剂的步骤，且当所述珠子是磁性珠子时，该磁性珠子是具有可修饰的官能团酰胼基团或氨基氧基基 团的珠子。3.根据权利要求1的方法，其还包括下列步骤中的至少一个步骤 A)释放样品中的糖链的糖链释放步骤，该步骤包括下列步骤 A-1)将作为样品的血清提供在过滤板上的步骤；A-2)添加1-丙磺酸、2-羟基-3-月桂酰胺(PHL)或者1-丙磺酸、2-羟基-3-肉豆蔻 酰胺(PHM) /碳酸氢铵，并使混合物在25-42 °C反应5_60分钟的步骤；A-3)添加二硫苏糖醇(DTT)至样品中，使混合物在50-80°C反应10-60分钟，然后冷却 反应混合物至室温的步骤；A-4)添加碘乙酰胺(IAA)，并使混合物在黑暗中于室温反应0. 5-2小时的步骤； A-5)添加胰蛋白酶至样品中，并使混合物在25-42°C反应30-120分钟的步骤； A-6)加热样品至80-100°C，持续1-10分钟，然后冷却样品至室温的步骤；和 A-7)加入PNGaseF，并使混合物在25-42°C反应6_24小时的步骤；B)制备用于在检测中使用的释放的糖链的检测样品制备步骤，所述步骤包括下列步骤B-1)使步骤(A)中制备的捕获的糖链样品与用于捕获糖链的珠子接触，从而在40°C或 更高的温度(例如80°C )下结合，并由此产生捕获的糖链样品的步骤；B-2)添加盐酸胍到捕获的糖链样品中，然后将捕获的糖链样品置于反应条件下，然后 通过抽吸除去反应液体的步骤；B-3)用水洗涤捕获的糖链样品，然后通过抽吸除去水的步骤； B-4)用三乙胺洗涤捕获的糖链样品，然后通过抽吸除去三乙胺的步骤； B-5)添加乙酸酐到捕获的糖链样品中，然后将捕获的糖链样品置于反应条件下，所述 反应条件即使用10%乙酸酐/甲醇在室温反应10分钟至2小时，然后通过抽吸除去乙酸酐 的步骤；B-6)添加盐酸至捕获的糖链样品中，并通过抽吸除去盐酸的步骤； B-7)添加甲醇到捕获的糖链样品中，通过抽吸除去甲醇，然后添加二氧六环到捕获的 糖链样品中的步骤；B-8)用棉布擦拭底部的步骤；B-9)添加甲基-对_甲苯基_三氮烯(MTT)到捕获的糖链样品中，并使混合物在60°C 或更高的温度反应30-120分钟(例如60分钟)；B-10)添加二氧六环到捕获的糖链样品中，并通过抽吸除去二氧六环的步骤； B-11)依次用甲醇、NaCl溶液和水洗涤捕获的糖链样品，然后通过抽吸除去水的步骤； B-12)添加乙酸和乙腈到捕获的糖链样品中，并利用氨基氧基色氨酰基精氨酸甲酯/ 水、盐酸0-苄基羟胺/水或邻氨基苯甲酰胼/水标记捕获的糖链样品中的糖链的步骤；和 B-13)添加水到标记的捕获的糖链样品中以产生标记的糖链样品溶液的步骤；C)制备具有点样于其上的标记的捕获的糖链样品的用于质谱测试的板子的步骤，该步 骤包括C-1)在用于回收的板子上处理步骤(B)中得到的标记的糖链样品溶液的步骤； C-2)在用于混合的板子上处理来自用于回收的板子上的标记的糖链样品溶液和乙腈， 以达到80-90%的乙腈终浓度的步骤；C-3)提供正相模式的附着有固相载体的板子的步骤；C-4)依次用水和乙腈洗涤附着有固相载体的板子，并通过抽吸除去水和乙腈的步骤； C-5)添加标记的糖链样品溶液到附着有固相载体的板子中，除去液体，用乙腈洗涤板 子，并向其中添加1-20%乙腈的步骤；C-6)通过抽吸从附着有固相载体的板子回收珠子至第二个用于回收的板子的步骤；和C-7)添加在20-40%乙腈中的2，5_ 二羟基苯甲酸到标记的糖链样品溶液中，并混合和 点样该混合物的步骤；和D)通过MALDI-TOF MS完成质谱法的步骤。4.根据权利要求3的方法，其中糖链捕获珠子是磁性珠子，并且分离利用磁场进行而 不是通过抽吸除去来进行。5.制备用于分析样品中的糖链的预处理样品的方法，该方法包括下列步骤A)释放样品中的糖链的糖链释放步骤，该步骤包括下列步骤 A-1)将样品提供在用于反应的板子上的步骤；A-2)添加增溶剂到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤； A-3)添加还原剂到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤； A-4)添加-SH保护剂到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤； A-5)添加蛋白水解酶到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤； A-6)灭活蛋白水解酶的步骤；和 A-7)添加糖链释放酶到样品中以释放糖链的步骤；和B)制备在检测中使用的释放的糖链的检测样品制备步骤，该步骤包括下列步骤 B-1)使步骤(A)中制备的样品与珠子接触，然后将样品置于使样品中释放的糖链结合到珠子的条件下，并由此产生捕获的糖链样品的步骤；B-2)添加蛋白变性剂到捕获的糖链样品中，然后将捕获的糖链样品置于反应条件下的 步骤；B-3)洗涤捕获的糖链样品，然后通过抽吸除去残留的洗涤液体的步骤； B-4)添加珠子上的糖链捕获剂的盐释放剂到捕获的糖链样品中，然后通过抽吸除去盐 释放剂的步骤；B-5)添加保护剂到捕获的糖链样品中，然后将捕获的糖链样品置于反应条件下的步骤；B-6)添加酸到捕获的糖链样品中，并通过抽吸除去酸的步骤； B-7)添加有机反应溶剂到捕获的糖链样品中的步骤； B-8)除去珠子中的溶剂和水分的步骤；B-9)添加烷基酯化剂到捕获的糖链样品中，然后将捕获的糖链样品置于反应条件下， 并将唾液酸的羧酸烷基化的步骤；B-10)添加有机反应...

【专利技术属性】
技术研发人员：西村绅一郎，篠原康郎，三浦嘉晃，山崎博司，堀内道雄，本木宏昭，黑田寿晴，喜多阳子，中野美佳，
申请(专利权)人：国立大学法人北海道大学，系统工具有限公司，盐野义制药株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]