转录因子诱饵、组合物和方法技术

用于鉴定及使用顺式调节和诱饵序列的组合物及方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术提供了用于鉴定顺式调节序列的方法和组合物。本专利技术还涉及通过改变体 内转录因子与顺式调节元件的结合，伴随着基因表达样式的改变，用于特异性调控细胞表 型例如原核表型的方法和组合物。
技术介绍
基因表达是细胞表型的主要决定因素，而DNA-蛋白相互作用则在很大程度上决 定了基因表达样式。在工业微生物、实验模型、病原体中或为了解决人类疾病，改变基因表 达以致影响表型是生物学和医学的主要目标。在本文中，基因组中的顺式调节序列(转录 机的DNA成分)是具有吸引力的用于干预的靶标。与对付蛋白相比，对DNA起作用远远容 易得多测序高度自动化且相对便宜，并且DNA能容易操纵并易于扩增或合成。基于DNA的 治疗也已涌现为一类令人激动的新治疗药物。与传统药物(天然产物或小分子)相比，DNA 是一类具有吸引力的治疗药物，因为其能·通过理性方法设计，最简单的是通过研究序列数据来进行；·规模化便宜制备，通过化学合成寡核苷酸或生物学复制来进行；·预计具有低毒性，因为DNA是一种‘天然’化合物且其中或自身通常不会诱导免 疫应答，并且特异性能通过基于DNA治疗的序列得到控制；·大大降低了研发经费，因为缩短了常规药物开发的全部阶段(靶标鉴定、先导化 合物发现、药物化学)。因而，挑战就变成了如何鉴定关键的顺式调节元件。在基因组测序计划的同时所 开发的技术和专门知识，例如利用DNA微阵列的大规模并行基因表达分析以及使用生物信 息学来注释基因组数据库，皆不足以鉴定所有顺式调节元件或将功能归属于已知的那些顺 式调节元件。在2003年，美国国家卫生研究院启动了 ENCODE计划以编目人基因组中的顺式调节元件(Science (2004) 306 :636_640 ；Nature (2007) 447 :799_816)并开发高通 量技术作为发现平台。该开发的方法包括使用染色质免疫沉淀反应，超灵敏地探查对体内 DNA酶I消化的敏感性(使用DNA微阵列、高通量定量PCR和基因组文库)并开发用于生 物信息检测的新算法。虽然这些技术具有大大加速顺式调节元件发现的潜力，但是它们未 必会产生它们的功能特征该计划的输出结果是这些元件的综合性编目。虽然从该项工作 中，根据哪一种类型的反式作用因子结合它们，有可能获知大多数元件的组织特异性，以及 它们与基因的距离和分类，但是其仍不足以确定元件的生物功能实际上是什么。对于所有 这些方法而言，所共有的进一步的缺点在于它们依赖被测序的生物体的基因组。此外，利用 对DNA酶I消化的超灵敏性的方法具有额外的缺点，即它们特异于真核细胞，因为在该环境 中DNA酶I是染色质结构的探针，而在原核生物中则无可比较的结构存在。此外，迄今尚无用于针对大量序列快速筛选可能的顺式调节序列的手段。专利技术概述本专利技术人通过提供用于在原核和真核生物中鉴定及表征顺式调节序列的新方法 解决了本领域中的这些问题。一种鉴定并表征各顺式调节元件功能的方式是使用转录因子诱饵(decoy) (TFD)。 设计诱饵寡核苷酸以模拟转录因子结合位点并阻止后者与它们的关连基因组靶标结合，随 之发生基因表达的改变。同样，它们代表了一种用于操纵DNA-蛋白相互作用的简单且通 用的手段，其调节特定基因并因此决定表型。业已主要在真核系统中证实了它们的效用， 在该系统中鞭策它们开发的是它们起新一类治疗剂作用的潜力(Marm&DzaU(2000) J. Clin. Investigation 106:1071-1075)。为此，诱饵寡核苷酸已被用于证实转录因子EF2抑制 大鼠中平滑肌增殖(Morishita 等(1995)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5855-5859)；阻断 STAT3 介导的癌增殖(Leong 等(2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:4138-4143)；以及显 示靶向cAMP应答元件能控制体内癌增殖(Park等(1999) J. Biol. Chem. 274 1573-1580)。然而，尚未开发能查询基因组片段或全基因组中序列的每一事件的大规模使用 TFD的系统。按照实际情况来说，其应当需要合成非常大量的诱饵寡核苷酸以及涉及它们转 染和对表型改变进行筛选的繁重实验程序。这里描述的本专利技术通过开发基于质粒携带文库的系统解决了该需要，该系统能系 统地测试大量序列以确定它们是否在基因组中充当顺式调节子，并将它们与特定表型效应 相关联。我们在此将该系统称为“n[圈套]，，(snare)。此外，一旦发现相关顺式调节序列，那些序列可用于创建TFD，该TFD可用于改变 基因表达并获得对表型的控制。出于数项原因，尽管诱饵被开发用于哺乳动物细胞，但是 它们更好地适用于细菌中。在真核生物中让诱饵起作用可能存在问题，原因在于它们在 血清和细胞核提取物中能快速降解(Chu&Orgel (1992)Nucl. Acids. Res. 20 :5857_5858)， 诱饵的细胞摄取及其跨核膜迁移可能是无效的(Griesenbach等(2002)Gene Therapy 9 1109-1115)，以及某些处理能触发非特异性或毒性效应。在原核生物中使用诱饵回避了大 多数的这些问题，因而它们能被证实是一种有效用于顺式作用调节序列例如控制特定基因 和较大调节网络的转录因子结合位点快速鉴定的工具。该方法的一个成功的示范是使用 富含AT的诱饵来改变蓝细菌中CO2应答基因的表达(Onizuka等(2003)FEBS Lett. 542 42-46)。在该系统中，退火带有修饰的主链的互补寡核苷酸(包含硫代磷酸酯以减缓核酸 酶降解)形成掺入之前鉴定的转录因子结合位点的双链诱饵寡核苷酸。将这些双链诱饵寡 核苷酸直接加到其有效从中进入细胞的培养基中。然而，所报道的仅仅是一个实例，我们知 道在该方法中已成功地尝试改变特定的原核性状。因此，在本领域中仍然需要将该诱饵方 法学扩展到原核转录因子领域中，以从而改变广泛原核表型。此外，在本领域中还需要用于 鉴定顺式作用调节因子的高通量方法，无论是在原核或在真核系统中。本专利公开内容提 供了针对本领域的上述局限和需要的解决方案。在一个具体的方面，本专利技术提供了用于增加细胞如细菌细胞对抗生素敏感性的新 手段。因此，在一方面本专利技术提供了诱饵多核苷酸在调控细胞抗生素抗性的方法中的应 用，该方法包括(a)提供包含转录因子结合位点(诱饵序列)的诱饵多核苷酸；并(b)将该多核苷酸导入细胞中，其中细胞包含可操作地连接包含转录因子结合位 点的顺式调节序列的一种或更多种基因；其中多核苷酸的导入减少了细胞中转录因子与顺式调节序列的结合并导致细胞中可操作地连接的一种或更多种基因表达的改变，从而调控细胞的抗生素抗性。本专利技术还提供了 -一种包含转录因子结合位点的诱饵多核苷酸，其中转录因子是原核生物或真核 生物中一种或更多种抗生素抗性基因表达的调节子，以及其中诱饵多核苷酸中的结合位点 不与基因可操作地连接。-一种包含一个或更多个拷贝的单体序列的质粒，其中单体序列包含圈套序列，该 圈套序列包含转录因子结合位点，以及其中结合位点不与基因可操作地连接。-一种包含两个或更多个本专利技术的质粒的质粒文库，本文档来自技高网...

【技术保护点】
诱饵多核苷酸在调控细胞抗生素抗性的方法中的应用，该方法包括：（ａ）提供包含转录因子结合位点（诱饵序列）的诱饵多核苷酸；并（ｂ）将该多核苷酸导入细胞中，其中细胞包含可操作地连接包含转录因子结合位点的顺式调节序列的一种或更多种基因；其中多核苷酸的导入减少了细胞中转录因子与顺式调节序列的结合并导致细胞中可操作地连接的一种或更多种基因表达的改变，从而调控细胞的抗生素抗性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】GB 2007-10-3 0719367.5诱饵多核苷酸在调控细胞抗生素抗性的方法中的应用，该方法包括(a)提供包含转录因子结合位点(诱饵序列)的诱饵多核苷酸；并(b)将该多核苷酸导入细胞中，其中细胞包含可操作地连接包含转录因子结合位点的顺式调节序列的一种或更多种基因；其中多核苷酸的导入减少了细胞中转录因子与顺式调节序列的结合并导致细胞中可操作地连接的一种或更多种基因表达的改变，从而调控细胞的抗生素抗性。2.根据权利要求1的应用，其中细胞中可操作地连接顺式调节序列的一种或更多种基 因编码对抗生素的抗性。3.根据权利要求1或2的应用，用于调控对选自如下的一种或更多种的抗生素的抗 性氨基糖苷类；碳青霉烯类；头孢菌素类；糖肽类；青霉素类；多肽类抗生素；喹啉类；磺 胺类；或四环素类。4.根据权利要求3的应用，其中抗生素选自如下的一种或更多种卡那霉素、美罗培 南、头孢吡肟、万古霉素、达托霉素、氨苄青霉素、羧苄青霉素、青霉素、多粘菌素B、左氧氟沙 星、菌特灵(Bactrim)、四环素、氯霉素、利福平和斯沃(Zyvox)。5.根据前述权利要求任一项的应用，其中可操作地连接顺式调节序列的一种或更多种 基因编码对万古霉素的抗性。6.根据权利要求5的应用，其中转录因子是VanR转录因子。7.根据前述权利要求任一项的应用，其中细胞是(a)抗生素抗性的非致病模型；或(b)病原体。8.根据前述权利要求任一项的应用，其中细胞是(a)选自如下的属的革兰氏阳性细菌放线菌属；链霉菌属；分枝杆菌属；梭菌属；芽 孢杆菌属；李斯特氏菌属；葡萄球菌属；链球菌属；肠球菌属；或(b)选自如下的属的革兰氏阴性细菌肠杆菌科；假单胞菌属；莫拉氏菌属；螺杆菌属； 寡养单胞菌属；蛭弧菌属；醋酸细菌；军团菌属；蓝细菌属；螺体属；绿色硫细菌；和绿色无 硫细菌。9.根据前述权利要求任一项的应用，其中细胞是选自如下的病原体结核分枝杆菌； 牛分枝杆菌；非洲分枝杆菌；田鼠分枝杆菌；麻风分枝杆菌；艰难梭菌；肉毒梭菌；产气荚 膜梭菌；破伤风梭菌；沙门氏菌；大肠杆菌；屎肠球菌；粪肠球菌；淋病奈瑟氏菌；脑膜炎奈 瑟氏菌；卡他莫拉氏菌；流感嗜血杆菌；肺炎克雷伯氏菌；嗜肺军团菌；铜绿假单胞菌；奇 异变形杆菌；阴沟肠杆菌；粘质沙雷氏杆菌；幽门螺杆菌；肠炎沙门氏菌；和伤寒沙门氏菌。10.根据前述权利要求任一项的应用，其中细胞是万古霉素抗性病原体或万古霉素抗 性的非致病模型。11.根据前述权利要求任一项的应用，其中诱饵多核苷酸中的转录因子结合位点不与 基因可操作地连接。12.根据前述权利要求任一项的应用，其中诱饵多核苷酸包含环状双链DNA或线型寡 核苷酸；和/或至少一个二级结构元件；和/或多于一个拷贝的转录因子结合位点；和/或 附加到结合位点上的额外的序列；和/或增加多核苷酸核酸酶抗性的修饰的碱基或糖；和/ 或质粒或质粒文库。13.根据权利要求12的应用，其中诱饵多核苷酸包含环状 铃状体。14.根据权利要求12的应用，其中诱饵多核苷酸包含多个同向重复的结合位点。15.根据权利要求12的应用，其中诱饵多核苷酸包含具有至少一个5’胆固醇修饰的线 型寡核苷酸。16.根据权利要求12的应用，其中诱饵多核苷酸包含质粒以及其中该质粒具有一个或 更多个拷贝的包含圈套序列的单体序列，该圈套序列包含转录因子结合位点，其中结合位 点不与基因可操作地连接。17.根据权利要求16的应用，其中质粒包含(a)2个或更多个或至少10、20或30个拷贝的单体序列；和/或(b)串联重复的单体序列。18.根据权利要求16或17的应用，其中单体额外包含(a)引物结合位点，其中该引物适用于滚环扩增；和/或(b)一种或更多种限制酶的识别和/或切割位点。19.根据权利要求16-18任一项的应用，其中单体包含10-1000个或10-500个核苷酸。20.根据权利要求16-19任一项的应用，其中圈套序列包含10-30个核苷酸或15-20个核苷酸。21.根据权利要求16-20任一项的应用，其中质粒是广宿主范围或穿梭载体和/或是高 拷贝数质粒。22.根据前述权利要求任一项的应用，其中诱饵多核苷酸中的转录因子结合位点包含 SEQ ID NO 21 或 SEQ ID NO 26 的序列。23.一种包含转录因子结合位点的诱饵多核苷酸，其中转录因子是原核生物或真核生 物中一种或更多种抗生素抗性基因表达的调节子，以及其中诱饵多核苷酸中的结合位点不 与基因可操作地连接。24.根据权利要求23的诱饵多核苷酸，其如权利要求12-22任一项所定义。25.一种包含一个或更多个拷贝的单体序列的质粒，其中单体序列包含圈套序列，该圈 套序列包含转录因子结合位点，以及其中结合位点不与基因可操作地连接。26.根据权利要求25的质粒，其包含(a)2个或更多个或至少10、20或30个拷贝的单体序列；和/或(b)串联重复的单体序列。27.根据权利要求25或26的质粒，其中单体额外包含(a)引物结合位点，其中该引物适用于滚环扩增；和/或(b)一种或更多种限制酶的识别和/或切割位点。28.根据权利要求25-27任一项的质粒，其中单体包含10-1000个或10-500个核苷酸。29.根据权利要求25-28任一项的质粒，其中圈套序列包含10-30个核苷酸或15-20个核苷酸。30.根据权利要求25-29任一项的质粒，其中质粒是广宿主范围或穿梭载体和/或是高 拷贝数质粒。31.根据权利要求25-30任一项的质粒，其用于原核细胞。32.根据权利要求25-31任一项的质粒，其中转录因子结合位点包含顺式调节序列或与之竞争转录因子结合，该顺式调节序列调节编码原核生物或真核生物中抗生素抗性的一 种或更多种基因的表达。33.根据权利要求32的质粒，其中一种或更多种基因编码对选自如下的一种或更多种 的抗生素的抗性氨基糖苷类；碳青霉烯类；头孢菌素类；糖肽类；青霉素类；多肽类抗生 素；喹啉类；磺胺类；或四环素类。34.根据权利要求33的质粒，其中抗生素选自如下的一种或更多种卡那霉素、美罗培 南、头孢吡肟、万古霉素、达托霉素、氨苄青霉素、羧苄青霉素、青霉素、多粘菌素B、左氧氟沙 星、菌特灵、四环素、氯霉素、利福平和斯沃。35.根据权利要求34的质粒，其中转录因子是VanR转录因子。36.根据权利要求35的质粒，其中转录因子结合位点包含SEQID N0:21或SEQ ID NO:26。37.一种包含两个或更多个的根据权利要求25-36任一项的质粒的质粒文库，其中文 库中的圈套序列共同包含原核生物或真核生物基因组DNA或基因组DNA片段中所有或基本 上所有的顺式调节序列。38.根据权利要求37的质粒文库，其中基因组DNA或其片段包含编码抗生素抗性的一 种或更多种基因。39.一种包含两个或更多个的根据权利要求25-36任一项的质粒的质粒文库，其中每 个质粒中的圈套序列都包含长度η个核苷酸的随机化核苷酸序列，其中基本上所有的长度 η个核苷酸的核苷酸序列都呈现在文库中。40.一种制备具有两个或更多个拷贝的单体序列的质粒的方法，该方法包括(1)提供包含如下的环状寡核苷酸(1)包含转录因子结合位点的目标测试序列；和( )适用于滚环扩增的引物的结合位点；其中单体序列包含(i)和(ii)；(2)使用环状寡核苷酸作为模板进行滚环扩增，从而提供包含单体序列重复的多核苷 酸；并(3)将该多核苷酸克隆入质粒载体中。41.根据权利要求40的方法，其中步骤(1)包括_提供包含如下的线型单链寡核苷酸目标测试序列(i)和适用于滚环扩增的引物的 结合位点(ii)；-环化寡核苷酸；-任选地用外切核酸酶消化残留的线型DNA ；并-回收单体环状寡核苷酸。42.根据权利要求40或41的方法，用于制备根据权利要求25-36任一项的质粒或根 据权利要求37-39任一项的质粒文库，其中目标测试序列(i)包含转录因子结合位点。43.一种自基因组DNA样品制备质粒文库的方法，其中每个质粒都包含一个或更多个 拷贝的单体序列，以及其中每条单体序列都包含来源于基因组DNA的圈套序列；该方法包 括(1)提供包含编码抗生素抗性的一种或更多种基因的双链基因组DNA样品；(2)片段化基因组DNA;(3)将衔接头连接到来自(2)的DNA片段的每一末端上，其中每一衔接头包含(iii)用于固定DNA片段的手段；(iv)在与该识别位点隔开一段距离切割的第一限制酶的识别位点； 禾口(ν)第二限制酶的识别和切割位点；(4)任选地除去未连接的衔接头；(5)用第一限制酶消化带有衔接头的片段，从而产生两条衔接片段，其中每条衔接片段 包含(vi)衔接头；和(vii)包含如下的DNA片段较短的链，和较长的链，其中较长的链包含圈套序列；(6)固定(5)中产生的衔接片段；(7)变性该片段以提供单链片段；(8)通过将互补寡核苷酸连接到衔接头来再建第二限制酶识别位点并用第二限制酶消 化该衔接片段，从而产生包含如下的衔接头_圈套片段(viii)衔接头片段；和(ix)单链圈套序列；(9)从固定状态释放(8)中产生的衔接头_圈套片段；并(10)将该衔接头_圈套片段克隆入质粒载体中。44.根据权利要求43的方法，其中每个质粒都包含两个或更多个拷贝的单体 序列以及其中步骤(10)进一步包括-提供包含如下的环状寡核苷酸(i)衔接头_圈套片段；和( )适用于滚环扩增的引物的结合位点；其中单体序列包含(i)和(ii)；-使用环状寡核苷酸作为模板进行滚环扩...

【专利技术属性】
技术研发人员：迈克尔麦克阿瑟，
申请(专利权)人：普罗卡塔生物系统有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]