针对LCT中毒的药物制造技术

用于预防或减轻大梭菌细胞毒素(LCT)中毒的药物，特别是艰难梭 菌毒素A和B(TcdA和TcdB)，其特征在于，作为活性物质，至少含 有一种效应剂，即LCT(大梭菌细胞毒素)自催化性蛋白酶活性的抑 制剂或激活剂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】针对LCT中毒的药物本专利技术涉及用于预防或减轻大梭菌细胞毒素(LCTs)，特别是艰 难梭菌毒素A和B ( TcdA和TcdB )、索氏梭菌致命毒素(TcsL )及诺 维氏梭菌a毒素(Tcna )中毒的药物。艰难梭菌(Clostridium difficile)是严格厌氧生长、产生孢子 的革兰氏阳性菌，于70年代末才被鉴定为与抗生素相关的腹泻和假膜 性结肠炎的病原体。从90年代起艰难梭菌被认为是发展中国家最重要 的医院病菌。作为愈加广泛地使用广谦抗生素的后果，尤其是对于住 院治疗的患者，艰难梭菌感染的发病率进一步持续上升。与艰难梭菌相关的疾病是由艰难梭菌所产生的外毒素毒素A (TcdA)和B (TcdB)引起的。存在显示不同毒性和毒素产生的不同 菌抹。大约所有菌林的四分之一不产生毒素。产生毒素的菌株几乎总 是产生这两种毒素。TcdA是肠毒素，其通过对肠细胞的细胞毒性损害 提高小肠粘膜上皮的渗透性并由此引起腹泻。TcdB是细胞毒素，其干 扰电解质输送并引起小肠脱水及功能紊乱。TcdA和TcdB属于所谓的 大梭菌细胞毒素(LCTs)，分别由具有3个功能结构域的肽链组成， 即负责毒素与宿主细胞膜缀合的C端结构域，负责穿越细胞膜的转运 的疏水的中间结构域，和具有糖基转移酶功能和介导分子毒性活性的 N端结构域。尽管毒素被摄入宿主细胞的过程还未完全弄清，但被认作事实的是，毒素在与宿主细胞受体缀合后通过胞吞作用进入宿主细胞，N端 催化结构域被切离且被转运至宿主细胞胞浆内以发挥其毒性。在胞浆 内催化结构域将Rho-亚族(Rho, Rac和Cdc42 )的GTP酶特异地糖基 化(所述Rho-亚族本身参与大量信号传导级联)，并以这种方式阻断 相关的信号传导过程，从而最终导致细胞骨架的解聚和细胞死亡。 迄今为止，现有技术的出发点在于，TcdA和TcdB和其它大梭5菌细胞毒素LCT的毒素肽链上的N-端催化结构域的切离，被一种细 胞蛋白酶催化(Rupnik等人，2005和Pfeiffer等人，2003 )。但是却 不能提供相应的证据。然而在本专利技术以之为根据的研究过程中，令人惊奇地发现，TcdA 和TcdB的裂解是自催化的过程，该过程由磷酸肌醇(IP)启动，因此 艰难梭菌毒素除了它的糖基转移酶的催化功能之外，还具有用于自我裂解和自催化性裂解的蛋白酶功能。该蛋白酶功能被鉴定为天门冬氨酸蛋白酶。鉴定为蛋白酶催化中 心的蛋白区域是，涉及根据序列号P18177( SwissProt/TrEMBL )的TcdB 的氨基酸位置从AS 1653至AS 1678的氨基酸序列。表征天门冬氨酸 蛋白酶的DXG基序(Rao等人)处于氨基酸位置1665。鉴定为磷酸肌醇结合位点的蛋白区域是，涉及根据序列号P18177 (SwissProt/TrEMBL )的TcdB蛋白的氨基酸位置从AS 1517至AS 2142 的氨基酸序列。该氨基酸序列展现肌苷-5-单磷酸-脱氢酶(IMPDH )基 序，该基序由两个区域构成，即AS 1517-AS 1593和AS 1918-AS 2142， 它们通过325个氨基酸长的无序列同源性的蛋白质片段分隔开。为了治疗艰难梭菌感染的患者，首先要尽可能停用所述引发性抗 生素。进一步的治疗仅仅针对症状进行。在较长持续的或者严重的病 程情形下，以及如果出于其它原因不可能停用所述引发性抗生素，则 施用甲硝唑或者万古霉素用于治疗。常用的抗生素治疗的缺点是多方面的。在此尤其重要的是，因为 用抗生素治疗另一种感染状况而引起的疾病，无法用抗生素治疗有效 治愈。其背景是以下事实，艰难梭菌在健康人的肠腔内只相对很少地 出现，并且相对于正常的肠菌丛不能够发展。如果正常的肠菌丛经抗 生素治疗而破坏，艰难梭菌能得以发展并有效地安顿于小肠。针对抗 艰难梭菌的抗生素治疗再度导致肠菌丛的破坏并由此在因果上还阻止 健康肠菌丛的产生。这也解释了抗生素治疗结束后所观察到的緩解 (Remissionen)的高数目。常用的抗生素治疗的额外缺点是，近期多 重抗药性的艰难梭菌属种越来越多地出现。从而威胁到，使目前用于艰难梭菌诱发的疾病的唯一疗法失效，并且因艰难梭菌疾病而死亡的 数目上升。另外，用于治疗艰难梭菌感染所必须的抗生素是非常昂贵 的，且通常只有在有理由的情况下作为保留抗生素使用。因而存在对药物的迫切需求，该药物适用于特定地防治(预防、 清除、緩解)艰难梭菌感染，而不存在梭菌或其它细菌发展耐药性的 风险，并且不会损害相关患者的自然菌丛-特别是肠菌群。本专利技术的任务是提供这样的药物。所述任务的解决方案在于提供文端所提及的类型的药物，其特征在于，包含至少一种效应剂作为活性物质，所述效应剂为LCTs (大梭 菌细胞毒素)自催化性蛋白酶活性抑制剂或激活剂，所述LCTs特别是 艰难梭菌毒素A (TcdA)和/或艰难梭菌毒素B (TcdB)，和/或索氏梭 菌致死毒素(TcsL )和/或诺氏梭菌oc毒素(Ten oc )。下文中，作为LCTs自催化性蛋白酶活性的效应剂，描述的既是 LCTs自催化性蛋白酶的激活剂，又是LCTs自催化性蛋白酶的抑制剂。如果所述活性物质或效应剂是抑制剂，则其抗毒性作用基于抑制 完整毒素(特别是TcdB或TcdA或TcsL或Tcnot )的蛋白酶活性，并 由此阻止细胞毒素的具有糖基转移酶功能的有效片段(在TcdB和TcdA 的情形下是63kDa片段)的切除。适合的抑制剂是抑制毒素的蛋白酶活性的化学物质。在上下文的阐述中，术语化学物质，，既表示无机化合物也表示 有机化合物、离子和肽或蛋白。优选的抑制剂是那些不可逆地抑制蛋白酶活性的化学物质。对此 的实例是物质EPNP (1，2-环氧基-3-(对-硝基苯氧基)-丙烷)。该 物质在蛋白酶催化中心与天冬氨酸残基不可逆反应并抑制所述蛋白水 解作用。其它蛋白酶抑制剂是本领域技术人员已知的或可以由他们用已知 的方法轻易鉴定的(计算机模拟、高通量筛选)。例如可以合成肽以 实施高通量篩选，该肽的氨基酸序列对应于LCTs的蛋白酶裂解位点的序列。通过这些肽链，例如运用本领域技术人员已知的方法与染料AMC(7-氨基，4-甲基-香豆素)的偶合可以产生探针。为实施高通量篩选将已标记的探针与毒素和候选物质放置一起。如果探针被裂解，则产生荧光光谱的变化。本领域技术人员用通常的方法轻易捕获该变化。试剂(Ansatze),其中观察到焚光光镨没有变化的即包含潜在的蛋白酶抑制剂。还示例性地描述了另一种方法用于鉴定影响LCTs自催化性蛋白酶活性的活性的物质。对此可以使用例如与染料连接的全毒素或者合适的毒素片段，所述染料的荧光在未裂解的毒素或者毒素片段中是淬灭的。通过毒素或毒素片段的自催化性裂解取消了淬灭性效应。该荧光光镨的变化，如所述，易于捕获。特别合适的抑制剂，即具有抑制作用的效应剂是化学物质，特别是蛋白质且其中尤其是抗体，通过与所述蛋白酶活性中心相互反应抑制LCTs的自催化性蛋白酶活性。在本专利技术的上下文中，术语相互反应意指在LCT与化学物质(特别是蛋白质)之间的任何类型的相互作用，并特别是包括共价键如双硫键和非共价键如范德华力、疏水或静电的相互作用以及氢桥键。在此优选蛋白质且其中尤其是抗体，其与分别根据TcdB-氨基酸序列号P1817本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于预防或减轻ＬＣＴ（＝大梭菌细胞毒素）中毒的药物，其特征在于，作为活性物质，含有至少一种效应剂，即ＬＣＴ（大梭菌细胞毒素）的蛋白酶活性的抑制剂或激活剂。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2006.8.2 DE 102006036373.6;2007.1.26 DE 1020070041.用于预防或减轻LCT(＝大梭菌细胞毒素)中毒的药物，其特征在于，作为活性物质，含有至少一种效应剂，即LCT(大梭菌细胞毒素)的蛋白酶活性的抑制剂或激活剂。2. 根据权利要求l的药物，其特征在于，所述活性物质是效应 剂，即艰难梭菌毒素A (TcdA)和/或艰难梭菌毒素B (TcdB)和/或索 氏梭菌致死毒素(TcsL)和/或诺氏梭菌a毒素(Tcnoc )的蛋白酶活 性的抑制剂或激活剂。3. 根据权利要求1或2的药物，其特征在于，所述抑制剂是1， 2-环氧-3-(对-硝基苯氧基)-丙烷(EPNP)。4. 根据权利要求3的药物，其特征在于，所述激活剂是磷酸肌 醇，特别是肌醇六磷酸(IP6)。5. 根据权利要求1或2的药物，其特征在于，所述效应剂是磷 酸肌醇的竟争抑制性结构类似物，特别是与肌醇六磷酸(IP6)竟争。6. 根据权利要求1或2的药物，其特征在于，所述激活剂是类 似IP6地促进LCT的(自催化性)蛋白酶活性，特别是促进TcdA和/ 或TcdB和/或TcsL和/或Tcncc的(自催化性)蛋白酶活性的物质。7. 根据权利要求1或2的药物，其特征在于，所述效应剂是适用于降低哺乳动物，特别是人类的肠腔内的磷酸肌醇浓度的化学物质。8. 根据权利要求1或2的药物，其特征在于，所述效应剂是适 用于降低哺乳动物细胞内，特别是人类细胞内的磷酸肌醇浓度的化学物质o9. 根据权利要求1或2的药物，其特征在于，所述抑制剂是与 蛋白酶活性中心相互作用的化学物质，特别是蛋白，尤其特别是抗体， 该活性中心根据TcdB氨基酸序列号P18177 (SwissProt/TrEMBL)在 AS 1500至AS 1800的TcdB蛋白区域中。10. 根据权利要求1或2的药物，其特征在于，所述抑制剂是与 根据TcdB氨基酸序列号P18177 (SwissProt/TrEMBL)的AS 1653至AS 1678的TcdB蛋白区域相互作用的化学物质，特别是蛋白，尤其特 别是抗体。11. 根据权利要求1或2的药物，其特征在于，所述抑制剂是与 根据TcdB氨基酸序列号P18177 (SwissProt/TrEMBL)的位于TcdB蛋 白的氨基酸位置AS 1665处的DXG基序相互作用的化学物质，特别是 蛋白，尤其特别是抗体。12. 根据权利要求1或2的药物，其特征在于，所述抑制剂是与 根据TcdA氨基酸序列号P16154 (SwissProt/TrEMBL)的AS 1651至 AS 1675的TcdA蛋白区域相互作用的化学物质，特别是蛋白，尤其特 别是抗体。13. 根据权利要求1或2的药物，其特征在于，所述抑制剂是与 根据TcdA氨基酸序列号P16154 (SwissProt/TrEMBL)的位于TcdA蛋 白的氨基酸位置AS 1662处的DXG基序相互作用的化学物质，特别是蛋白，尤其特别是抗体。14. 根据权利要求1或2的药物，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·冯埃歇尔斯特雷伯，J·雷尼克，S·藤泽，H·希尔德，M·鲁普尼克，
申请(专利权)人：美因茨约翰内斯古藤贝格大学，
类型：发明
国别省市：DE