血液凝固测试的标准品/参比品/对照品制造技术

通过合并不含血浆、白细胞和血小板的红细胞溶胞产物与不含血小板的人源血浆及抗微生物剂制备可在凝固测定中用作标准品、参比品、对照品、校验品、线性检验品或训练材料的基于全血的替代组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】血液凝固测试的标准品/参比品/对照品
技术介绍
1. 专利
本专利技术涉及人血液测试的材料和试剂领域。2. 现有技术描述测定血液凝固速度的测试可用于诊断出血异常和监测正经历治疗或服药 以防止血液凝块形成的患者的血液凝固行为。凝血酶通过涉及一系列血液凝固 因子的连续反应作用于血纤蛋白原(正常血液的一种可溶性组分)形成血纤蛋 白，进而导致血液凝固。凝血酶本身通过两种基础途径，外来途径和固有途径 由凝血酶原形成，不同凝固检验检测这些途径的一种或两种的活力。通过本领 域已知的测定方法，例如凝血酶原时间(PT)检测外来途径的活力，而内在途径 的活力通过本领域已知的测定方法，例如活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT) 测试。PT和APTT通过它们各自的方法用作发生血液凝固所需时间长度的标志。凝血酶原时间(PT)测试提供凝血酶原(也称为第II因子)以及四种其它凝固 因子-第I、 V、 VII和X因子存在和活性的标志。当一种或多种这些因子的水 平或活性异常地低，或者其活性被对象血液中的异常物质阻断时，PT值(以秒 表示)较高。在一些病例中，其是疾病情形的标志，而在其它病例中，高数值 是成功治疗的标志。例如，通过给予专门阻止或延迟血液凝块形成的药物，例 如肝素和华法林治疗某些医学情形。例如，经历华法林治疗的对象的PT值可以是健康对象获得的结果的约1.5-2.5倍。未经历这种药物治疗的健康对象的 PT值通常是约10-约13秒。通常先进行活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)测试，再进行外科手术 以证实该对象具有正常的血液凝固行为。与PT相似，APTT也用于监测血液 稀释药物，例如肝素的给药， 一般通过每两小时实施该测试并修正药物剂量直至获得最佳剂量。对于凝固行为正常的对象，APTT值为约25-约39秒。临床实验室可从商业供应商处获得用于PT和APTT测定的各种分析物和 试剂。 一种这样的供应商是美国新泽西州帕西帕尼的DS公司(Diagnostica Stago， Inc.， Parsippany， New Jersey, USA),其产品包括用于APTT测试 的STA-PPT[A]⑧试剂，用于PT测试的STA -Neoplastine CI+试剂。 STA-PPT[A]⑧试剂用于涉及有标准量的脑磷脂(用作血小板替代品)和特定 激活物存在下血浆再钙化的测试。STA-Neoplastine CI +试剂与促凝血酶原 激酶钙(calcium thromboplastin)联用。另一供应商是美国加利福尼亚州圣何 塞的HS公司(HemoSense， Inc., SanJose， California, USA)，其INRatio 计量仪是检测PT和国际标准化比率(INR)的测试装置，所述比率是患者PT 与某群体的正常平均PT之比。INRatio⑧计量仪利用重组人促凝血酶原激酶 试剂从一滴手指针刺新鲜毛细血管血获得这些数值并测定血纤蛋白原向血 纤蛋白转变后样品阻抗的变化。另一种测试装置是美国新泽西州东温莎的 i-STAT公司(i-STAT Corporation, East Windsor, New Jersey, USA)出售的 i-STAT⑧分析仪。该i-STAT⑧分析仪是含有人工凝血酶底物的手提式装置， 该底物含有类似于血纤蛋白原上位点的连接键，而凝血酶通常切割该连接 键以形成血纤蛋白凝块。血液样品中的凝血酶切割底物并释放电流计检测 的电活性化合物。还可利用i-STAT⑧分析仪检测活化凝血时间(ACT)，该时 间是凝血连锁完全活化所需的时间。可采用ACT测定，通过分析动脉和静 脉血液样品来监测中等和高水平肝素治疗。当有活化凝血酶存在时血纤蛋 白原转化成血纤蛋白导致大量或局部凝块形成时，表明完全活化。用作血液样品替代品的组合物通常与这些各种测试联用作为标准品、参比 品和对照品。这些组合物可用于监测仪器或装置的精密度和准确性，监测仪器 或装置所用任何试剂的状况和将患者样品与其它样品或固定值比较。当将具体 装置、仪器或方法介绍给新用户时，样品替代品也可用于培训目的。配制样品 替代品(为方便起见，本文称为对照品)的目的之一是获得一种组合物，其对可 能遇到的所有分析偏差与实际患者样品一样灵敏并能读取该测定的医学决定 点(medical decision point)范围内的数值。最佳组合物也可以是制备或重建后能 稳定数小时或数天的组合物。其它所需特征是成本低，易于制备和批次之间有再现性。目前可用的一种对照品是Stago STA-Coag对照品(DS公司目录号 00679)，其是一种两水平冻干对照品，含有分别代表正负水平的柠檬酸化 正常和异常人血浆。以商品名LYPHOCHEK⑧凝固对照品出售的三水平对 照品可购自美国加利福尼亚州赫拉克勒斯的生物辐射实验室公司(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, California, USA)(目录号744， 745和746)， 其用加工的人血浆和防腐剂制备。因为Stago STA-凝固对照品和 LYPHOCHEK 凝固对照品均不含红细胞材料，这些对照品均不是全血凝 固对照品。这是不利的，因为任何全血凝固测试的最佳对照材料，特别是 设计用于床边检验(point-of-care testing)的那些材料的构成应类似于检验的 实际样品，而由于缺乏红细胞和红细胞组分，基于血浆的对照品缺乏衍生 自全血的样品中存在的主要组分类别。分析对照系统公司(Analytical Control Systems, Inc.)的Speck， R.E.等在1999年8月17日授权的美国专利 号5,939,325中公开了稳定全血凝固对照品的配方。Speck对照品包含非灵 长类衍生的凝固因子与灵长类衍生的凝固因子的组合以弥补更不稳定的灵 长类衍生因子的活性随时间丧失。专利技术概述现已发现通过溶解从全血分离并经洗涤除去了血小板、白细胞和残留血浆 的红细胞并将溶胞产物与人源无血小板缓冲血浆及抗微生物剂混合可制备凝 固试验的稳定全血对照品。如果将得到的组合物冻干并用盐水重建，重建的对 照品在打开小瓶及封闭小瓶的保存条件下可保留其凝固活性几小时，在许多情 形中可保留几天。可通过各种方式，包括利用消除了凝固因子的血浆或这种血 浆与选择比例的含天然水平凝固因子的血衆的组合，或通过调节红细胞溶胞产 物与血浆之比将给定对照品的凝固活性调节至所需水平。专利技术详述与优选实施方式用于制备本专利技术对照品的红细胞可以是各种来源，例如人、猪、牛、马、 鸟、山羊或绵羊，但优选灵长类来源，最优选人来源。可通过常规方法，例如离心从全血收集红细胞，可用等渗缓冲洗涤溶液洗涤使收集的红细胞不含白细 胞、血小板(包括血小板膜组分)和残留的血浆。 一旦分离，可通过常规溶解技 术溶解红细胞。虽然可通过冷冻红细胞然后融化实现溶胞，但该过程不是必需 的，优选方法不是冻融。这些方法包括超声处理、渗透压休克和溶解细胞膜的 化学处理。将红细胞悬浮在低渗溶液，例如去离子水中充足时间以使细胞膜破 裂来实施渗透压休克。化学处理通常包括将红细胞与导致膜破裂的洗涤剂或表面活性剂接触。适合溶胞的洗涤剂和表面活性剂的例子是NP-40和其它乙氧基 壬基酚(n本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于血液凝固速度测定的具有基本不随时间变化的已知凝固特性的组合物，所述组合物包含：　通过溶解不含血浆、白细胞和血小板及血小板膜组分的红细胞获得的红细胞溶胞产物；　缓冲至ｐＨ约６．５－约７．５的不含血小板的人源血浆，所述不含血 小板的血浆是（ｉ）消除了凝固因子的血浆，（ｉｉ）含天然水平的凝固因子的血浆，或（ｉｉｉ）（ｉ）和（ｉｉ）的组合；和　抗微生物剂；　所述组合物缺乏血小板膜组分。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2006-8-4 11/462,4361. 一种用于血液凝固速度测定的具有基本不随时间变化的已知凝固特性的组合物，所述组合物包含通过溶解不含血浆、白细胞和血小板及血小板膜组分的红细胞获得的红细胞溶胞产物；缓冲至pH约6. 5-约7.5的不含血小板的人源血浆，所述不含血小板的血浆是(i)消除了凝固因子的血浆，(ii)含天然水平的凝固因子的血浆，或(iii)(i)和(ii)的组合；和抗微生物剂；所述组合物缺乏血小板膜组分。2. 如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述红细胞是灵长类来源的。3. 如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述红细胞是人源的。4. 如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述红细胞溶胞产物的血 红蛋白浓度是约1 g/dL-约25 g/dL。5. 如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述红细胞溶胞产物的血 红蛋白浓度是约1 g/dL-约15 g/dL。6. 如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述红细胞溶胞产物的血 红蛋白浓度是约10 g/dL-约15 g/dL。7. —种第一组合物和第二组合物的组合，所述各组合物如权利要求1所 述，其中所述红细胞溶胞产物和所述不含血小板的血浆具有选择的溶胞产物:血浆比例，所述第一组合物的所述溶胞产物:血浆比例不同于所述第二组合物的 所述溶胞产物:血浆比例，从而通过凝血酶原时间凝固测试检测到所述第一组 合物显示凝固时间范围是约9-约18秒，而所述第二组合物显示凝固时间约24 秒或更高。8. —种第一组合物和第二组合物的组合，所述各组合物如权利要求1所 述，其中所述不含血小板的血浆由选择比例的消除了凝固因子的血浆与含天然 水平凝固因子的血浆构成，所述第一组合物的所述比例不同于所述第二组合物的所述比例，从而通过凝血酶原时间凝固测试检测到所述第一组合物显示凝固时间范围是约9-约18秒，而所述第二组合物显示凝固时间约24秒或更高。9. 一种第一组合物和第二组合物的组合，所述各组合物如权利要求1所 述，其中所述红细胞溶胞产物和所述不含血小板的血浆具有选择的溶胞产物: 血浆比例，所述第一组合物的所述溶胞产物:血桨比例不同于所述第二组合物的 所述溶胞产物血浆比例，从而通过促凝血酶原激酶时间凝固测试检测到所述 第一组合物显示凝固时间范围是约25-约40秒，而所述第二组合物显示凝固时 间约60秒或更高。10. —种第一组合物和第二组合物的组合，所述各组合物如权利要求1所 述，其中所述不含血小板的血浆由选择比例的消除了凝固因子的血浆与含天然 水平凝固因子的血浆构成，所述第一组合物的所述比例不同于所述第二组合物 的所述比例，从而通过活化部分促凝血酶原激酶时间凝固测试检测到所述第一 组合物显示凝固时间范围是约25-约40秒，而所述第二组合物显示凝固时间约 60秒或更高。11. 一种制备用于血液凝固速度测定的具有基本不随时间变化的已知凝 固特性的组合物的方法，所述方法包括(A) 溶解不含血浆、白细胞和血小板及血小板膜组分的红细胞以形成溶胞 产物；(B) 合并所述溶胞产物与(a) 缓冲至pH约6.5-约7.5的不含血小板的人源血浆，所述不含血小 板的血浆是(i)消除了凝固因子的血浆，(ii)含天然水平的凝固因子的血浆，或 (iii)(i)和(ii)的组合，和(b) 抗微生物剂。12. 如权利要求11所述的方法，其特征在于，通过除冻融所述红细胞以 外的方法进行(A)所述的溶胞。13. 如权利要求ll所述的方法，其特征在于，通过超声处理进行(A)所述 的溶胞。14. 如权利要求ll所述的方法，其特征在于，通过渗透压休克进行(A)所 述的溶胞。15. 如权利要求11所述的方法，其特征在于，通过用化学溶解剂处理所 述红细胞来进行(A)所述的溶胞。16. 如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述红细胞是灵长类来源的。17. 如权利要求ll所述的方法，其特征在于，所述红细胞是人源的。18. 如权利要求11所述的方法，其特征在于，还包括冻干步骤(B)的产物。19. 如权利要求ll所述的方法，其特征在于，还包括(A')通过用盐水稀释 所述溶胞产物来处理所述溶胞产物以改变其中的血红蛋白浓度，再进行步骤 (B)。20. 如权利要求ll所述的方法，其特征在于，还包括(A')通过浓縮所述溶 胞产物来处理所述溶胞产物以改变其中的血红蛋白浓度，再进行步骤(B)。21. 如权利要求ll所述的方法，其特征在于，步骤(B)之前所述溶胞产物 的血红蛋白浓度是约1 g/dL-约25 g/dL。22. 如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：T霍，J科勒，A艾布拉赫姆，
申请(专利权)人：生物辐射实验室股份有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]