一种肺肿瘤实验动物模型的构建方法技术

本发明专利技术提供一种肺肿瘤实验动物模型的构建方法，包括：步骤一，在接种前４天开始予待接种犬口饲环孢霉素１０ｍｇ／ｋｇ；步骤二，制备ＣＴＶＴ组织块；步骤三，以１６Ｇ导引穿刺针穿刺至预定靶部位，将ＣＴＶＴ组织块２－３枚置入穿刺针内，并在ＣＴＶＴ组织块后放置无菌明胶海绵条，针芯将其推入肺组织后拔针。本发明专利技术以ＣＴＶＴ细胞为瘤株，利用其可移植性及遗传稳定的特性，通过肿瘤皮下细胞传代，制作肿瘤组织块，并以微创介入的方法进行肺内种植，建立了犬移植性肺癌模型，可以应用在大型动物肺部肿瘤的生长、侵犯和转移等相关实验研究。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及疾病的实验动物模型构建领域，具体涉及一种肺肿瘤实验动物模型的 构建方法。
技术介绍
近年来，随着动脉化疗栓塞、经皮消融(射频、微波、激光、冷冻)和经皮放射性粒 子植入等介入微创技术在肺部肿瘤的广泛应用，给大多数中晚期患者带来了控制病灶甚至 治愈的希望。但相关介入技术的基础实验研究却相对滞后，其主要原因之一是目前国内外 常见的肺肿瘤动物模型，多应用于病因及发病机制的研究，例如化学诱导模型、转基因鼠 模型和肿瘤异种移植模型等。不同的实验模型适用于不同的研究目的，其中可移植性的肿瘤实验模型如VX2瘤 在鼠和兔子上已经取得了成功，然而由于这些动物体型较小，造成应用相当局限。比较成熟 的、适合于介入治疗研究的大动物肺肿瘤模型却相对罕见。犬传染性性病肿瘤(Canine transmissible venereal tumor, CTVT)是一种犬类 动物生殖系统自然发生的圆细胞类肿瘤，传播主要以性接触为主，也可经舔咬传播。CTVS肿瘤具有以下几个特点第一，可靠的稳定性既往研究表明体外培养的 CTVT肿瘤细胞与移植性肿瘤的生物学特性均与原发肿瘤相似，没有显著的差异；第二，原 位移植的多样性=CTVT没有明显的组织特异性，可以在多种组织内进行生长，能够模拟多 种器官肿瘤的特性；第三，异种移植性CTVT的接种需要新鲜肿瘤组织，可以先移植至鼠建 立转移性的肿瘤，移植鼠的肿瘤组织又可以成功的接种到犬体内而致瘤，并且通过细胞学、 组织学及分子生物学研究均证实细胞的特性没有发生改变；第四，良好的模拟性，Ahrar等 研究表明将新鲜的CTVT组织浆液经皮注入或经动脉注入肺内可以很好的模拟人类肿瘤生 长及转移的模式。正是由于CTVT的上述特点，使其具备了成为移植瘤的必要条件。同时，CTVT —方 面解决了原位移植的问题，另一方面使移植肿瘤的各项指标接近人类疾病。动物犬的生活 习性与人类近似，体型较大，是非常适合行介入等研究的实验动物。肺移植瘤种植方式主要有以下几种第一种，移植瘤细胞悬液或组织浆液经皮穿刺植入。如国外Ahrar的实验中即采 用组织浆液，组织浆液或细胞悬液可经皮穿刺由较细穿刺针(20-22G)植入，其优点是创伤 小，操作容易，缺点是容易出现反流、弥散及胸膜种植等。第二种，组织块开胸植入，该种方法操作复杂，创伤较大，极易出现气胸、血胸等并 发症，轻者影响成瘤率，重者危及性命，导致动物实验成功率不高。第三种，组织块经皮穿刺植入，此方法理论上可有效避免细胞反流所致的胸膜种 植，但所需穿刺针较粗，其成功率及并发症在国内外未见相关报道。因此，利用肺移植瘤种植方式建立一个行之有效、成功率高的大动物肺肿瘤模型， 成为目前实验研究的迫切要求。
技术实现思路
针对上述缺陷，本专利技术的目的是提供，利用 CTVT肿瘤经皮穿刺建立一个成功率高的大动物肺肿瘤模型，满足目前实验研究的迫切要 求。为实现上述目的，本专利技术采用了以下的技术方案，包括以下步骤步骤一，在接种前4天开始予待接种犬口饲环孢霉素10mg/kg ；步骤二，制备CTVT组织块；步骤三，接种以16G导引穿刺针穿刺至预定靶部位，将CTVT组织块2-3枚置入穿 刺针内，并在CTVT组织块后放置无菌明胶海绵条，针芯将其推入肺组织后拔针。依照本专利技术较佳实施例所述的构建方法，所述CTVT组织块是无菌条件下以圆刀 片配合眼科剪将接种传代的CTVT肿瘤组织切制成，并且浸在Hank's液中冰存的1.5-2. Omm 的组织块。依照本专利技术较佳实施例所述的构建方法，在步骤一中，所述待接种犬在接种前4 天口饲环孢霉素，每日2次，两周后每日1次。依照本专利技术较佳实施例所述的构建方法，在步骤三中，在接种前晚对接种犬禁食、 禁水。依照本专利技术较佳实施例所述的构建方法，在步骤三进一步包括选择预接种点以 及理想穿刺点，并在消毒铺巾后，标记进针点。依照本专利技术较佳实施例所述的构建方法，所述肿瘤组织通过以下方式制备CTVT新鲜瘤株在Beagle犬皮下传代，6_8周后取CTVT荷瘤犬1只，消毒，铺巾，在 全麻条件下取出肿瘤组织，剔除周围包膜、肌肉、腱膜及血管，并置入Hank’ s液中。依照本专利技术较佳实施例所述的构建方法，所述接种是在全麻条件下取出肿瘤组织 后2小时内进行的。依照本专利技术较佳实施例所述的构建方法，所述待接种犬的平均体重为 10. 56 士 1. 86kg。由于采用了以上的技术方案，使得本专利技术相比于现有技术，具有如下的优点和积 极效果第一，本专利技术以CTVT细胞为瘤株，利用该细胞的可移植性及遗传稳定的特性，通 过肿瘤皮下细胞传代，制作肿瘤组织块，并以微创介入的方法进行肺内种植，在国内首次建 立了犬移植性肺癌模型，同时优化了国外报道的该模型的制作方法，可以广泛应用于大型 动物肺部肿瘤的生长、侵犯和转移等相关实验研究，也对于介入等治疗方法的疗效及监测 提供了合适的动物模型。第二，本专利技术采用的CTVT组织块接种方式，操作更加简单，成功率更高，成瘤周期 缩短，易于复制，成瘤后的胸腔积液及转移情况较少见，成瘤犬一般状态好，利于后续实验 的进行。第三，本专利技术采用了定向穿刺的方法，种植的目的性强，可以得到期望的肺叶成 瘤，有利于制作适合不同研究目的的肿瘤模型。当然，实施本
技术实现思路
的任何一个具体实施例，并不一定同时达到以上全部的技 术效果。附图说明图1是本专利技术的流程图。 具体实施例方式本专利技术的核心思想在于，以CTVT细胞为瘤株，利用其可移植性及遗传稳定的特 性，通过肿瘤皮下细胞传代，制作肿瘤组织块，并以微创介入的方法进行肺内种植，建立了 犬移植性肺癌模型，可以应用于大型动物肺部肿瘤的生长、侵犯和转移等相关实验研究。为便于理解以下结合附图，对本专利技术所提供方法的较佳实施例做进一步详细叙 述。本专利技术提供，包括以下步骤SlOl 在接种前4天开始予待接种犬口饲环孢霉素10mg/kg ；S102 制备 CTVT 组织块；S103 接种以16G导引穿刺针穿刺至预定靶部位，将CTVT组织块2-3枚置入穿刺 针内，并在CTVT组织块后放置无菌明胶海绵条，针芯将其推入肺组织后拔针。实施例为了便于对比实验效果，在本实施例中以CTVT细胞悬浮液穿刺接种与CTVT细胞 组织块穿刺置入接种两种方式分组对比来说明。一、实验前准备1、将实验动物及分组纯种Beagle犬18只，平均体重10. 56士 1. 86kg，随机分为两组CTVT组织块组6 只、CTVT细胞悬液组12只，每组雌雄均等。2、传代取瘤将CTVT新鲜瘤株先在Beagle犬皮下传代，6-8周后取CTVT荷瘤犬1只，消毒、铺 巾，全麻下取出肿瘤组织，剔除周围包膜、肌肉、腱膜及血管，置入Hank’ s液中。二、实验接种物制备1、CTVT细胞悬液的制备无菌条件下以圆刀片配合眼科剪将肿瘤组织切制成细碎组织块，细胞过滤筛分离 细胞和组织，离心去上清，沉淀物经Hank’ s液处理，苔盘蓝法细胞染色，行细胞活力测定后 调整活细胞浓度达到108/ml，抽取1. Oml肿瘤细胞悬液，置于冰上。2、CTVT组织块的制备无菌条件下以圆刀片配合眼科剪将肿瘤组织切制成1.5-2. Omm小组织块，浸入 Hank’ s液的试管中，置于冰上。三、肺内接种1、所有待接种犬接种前4天开始口饲环孢霉素10mg/kg，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肺肿瘤实验动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，在接种前４天开始予待接种犬口饲环孢霉素１０ｍｇ／ｋｇ；步骤二，制备ＣＴＶＴ组织块；步骤三，接种：以１６Ｇ导引穿刺针穿刺至预定靶部位，将ＣＴＶＴ组织块２－３枚置入穿刺针内，并在ＣＴＶＴ组织块后放置无菌明胶海绵条，针芯将其推入肺组织后拔针。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：董伟华，孙志超，安潇，肖湘生，刘士远，王智，刘洪超，高守红，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]