【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于转基因植物的培育
，特别涉及一种利用RNA干扰技术培育抗 粗缩病玉米的方法。
技术介绍
玉米粗缩病是由玉米粗缩病毒(MRDV)所引起的一种病毒病。国内学者研究表明， 此病是由灰飞虱传播的一种病毒性病害，其病原是一种具有双层衣壳的双链RNA球形病 毒，主要由灰飞虱传播，只侵染单子叶植物。其寄主范围较广，有玉米、小麦、水稻、谷子和黑 麦等。另外，还有一年生禾本科杂草，如狗尾、马塘、画眉、蟋蟀和白茅草等。田间冬小麦“绿 矮型病株”及与丛矮病毒(WRSV)混生的矮缩病株，即是玉米粗缩病的初侵染源。研究资料 表明，在玉米上传毒并造成危害的主要是灰飞虱第1代成虫，而灰飞虱则又是玉米粗缩病 的主要传毒介体。研究结果表明，麦套夏玉米一般3 5片叶即可感病，而且感病越早，发 病越重，经济产量损失也越大！近年来，山东、山西、河北、北京、天津、陕西、云南等地都有发病严重甚至绝产的报 道。玉米粗缩病已成为我国乃至世界玉米生产中的主要病害。发展到了不可忽视的地步。 针对玉米粗缩病的发生与环境条件、播种日期、品种抗病性等因素有关，目前也采取了调整 播期、加强田间管理、药物防治等措施来控制其发生，但是由于病毒繁殖快，易于变异，用传 统的防治方法不能从根本上解决这一问题。解决这一问题的有效策略是选育并推广抗病毒玉米品种。近年来逐渐兴起的RNA 干扰技术(RNA interference，RNAi)，为各种作物的抗病毒育种研究开辟了一条新的途径。 利用基因工程的方法可以将病毒基因导入优良玉米品种，获得对病毒的抗性。RNA干扰(RNA interference，RNAi...
【技术保护点】
一种利用ＲＮＡ干扰技术培育抗粗缩病玉米的方法，其特征在于：以ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１所述的核苷酸序列作为抗玉米粗缩病的目的基因序列，以ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２所述的Ｆ０核苷酸序列作为初始模板，分别以下述四对引物ｆ１／ｒ１、ｆ２／ｒ２、ｆ３／ｒ３、ｆ４／ｒ４依次进行ＰＣＲ扩增，下一对引物上下游的３’端分别与上一对引物上下游的５’端有部分碱基重叠，第一对引物以Ｆ０为模板，以后每一对引物以上一对引物的产物为模板，这样每次ＰＣＲ之后都在５’和３’端将目的序列延伸，最终扩增得到目的基因序列；四对引物分别如下：ｆ１：ＴＣＣＣＧＣＡＡＧＴＡＣＴＡＣＡＧＡＣＧＴＴＡＣＴＣＡＣＴＡＣＧＧＴＧＧＡＴＡＴＧＡＴＣＡＡＴＴＴＴＣＡＣ，ｒ１：ＧＣＴＧＡＡＡＣＧＧＧＴＡＴＴＡＴＧＣＴＡＡＧＡＣＴＡＡＴＡＴＴＧＴＡＡＡＡＧＡＧＡＴＴＣＡＡＡＣＧ；ｆ２：ＴＴＡＡＧＡＡＴＴＧＡＣＧＧＴＧＧＴＴＡＴＧＡＴＴＴＣＡＡＴＴＧＴＣＣＣＧＣＡＡＧＴＡＣＴＡＣＡＧＡＣ，ｒ２：ＡＡＣＡＣＴＴＡＡＴＴＣＣＴＴＴＴＣＡＡＡＴＡＧＡＴＧＡＡＣＧＧＴＴＴＴＴＡＡＡＧＣＴＧＡＡＡＣＧＧＧＴＡＴＴＡＴＧ；ｆ３：ＧＴＴＡＧＡＣＴＧＴＴＡＡＴＧＣＧＡＡ...
【技术特征摘要】
CN 2009-11-27 200910216417.0一种利用RNA干扰技术培育抗粗缩病玉米的方法，其特征在于以SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列作为抗玉米粗缩病的目的基因序列，以SEQ ID NO.2所述的F0核苷酸序列作为初始模板，分别以下述四对引物f1/r1、f2/r2、f3/r3、f4/r4依次进行PCR扩增，下一对引物上下游的3’端分别与上一对引物上下游的5’端有部分碱基重叠，第一对引物以F0为模板，以后每一对引物以上一对引物的产物为模板，这样每次PCR之后都在5’和3’端将目的序列延伸，最终扩增得到目的基因序列；四对引物分别如下f1TCCCGCAAGTACTACAGACGTTACTCACTACGGTGGATATGATCAATTTTCAC，r1GCTGAAACGGGTATTATGCTAAGACTAATATTGTAAAAGAGATTCAAACG；f2TTAAGAATTGACGGTGGTTATGATTTCAATTGTCCCGCAAGTACTACAGAC，r2AACACTTAATTCCTTTTCAAATAGATGAACGGTTTTTAAAGCTGAAACGGGTATTATG；f3GTTAGACTGTTAATGCGAACTGGTAAATTAAGAATTGACGGTGGTT，r3TTGTTCAAGCAAAGATTTGTCTGCATCCAAAACACTTAATTCCTTTTCAA；f4CCTGCTCAAATGGGAATACTTACTGATGAAGTTAGACTGTTAATGCGAACT，r4AACGAATGACGCTACTGCGCTCCAAGTTTGTTCAAGCAAAGATTTGT；将得到的目的基因序列经不同限制性内切酶酶切形成粘性末端，再用与其相同的限制性内切酶酶切中间载体pSK int，于1.0％琼脂糖凝胶电泳分离后回收酶切的目的条带，连接克隆入pSK int载体中，形成含正反向重复目的片段的中间载体pSK int FR303；用不同的两种限制性内切酶分别酶切中间载体pSK int FR303和植物表达载体pJIM19，电泳回收目的条带后将含正反向重复序列的目的片段连接到pJIM19载体中，即为构建成功的植物表达载体pJIM19 MRDV303；将植物表达载体pJIM19 MRDV303利用农杆菌介导法分别转入优良玉米的胚性愈伤组织，通过除草剂筛选、分化、生根壮苗，即获得再生转基因植株。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括下述主要步骤 (1)、玉米粗缩病病毒的RNAi载体的构建A.重叠PCR法扩增获得如SEQ ID NO. 1所述的目的基因序列 以SEQ ID NO. 1所述的核苷酸序列作为抗玉米粗缩病的目的基因序列，以SEQ ID NO. 2 所述的FO核苷酸序列作为初始模板，分别以四对引物fl/rl、f2/r2、f3/r3、f4/r4依次进 行PCR扩增具体步骤如下1)PCR扩增获得第一段序列首先合成目的基因片段的中间部分片段F0，即具有如SEQ ID N0.2所述的核苷酸序列， 再以FO为初始模板、以上游引物f 1和下游引物rl进行PCR扩增； 扩增体系为，每20 μ L中含有 10XPCR buffer 2. 0 μ L, dNTPs1. 6μ L,Mg2+1. 2μ L,DNA 模板l.OyL，上游引物fl0. 5yL,下游引物rl0. 5yL,rTaq 酶 ddH900. 2μ L, 13. 0μ L ；扩增程序为 94°C，5min ；94°C，30s，59°C，30s，72°C，30s ；30 个循环； 72°C，5min ； 10°C保温； 扩增得到第一段序列；2)PCR扩增获得第二段序列以步骤1)的产物为模板，以上游引物f2和下游引物r2进行PCR扩增；扩增体系为，每20 μ L中含有10XPCR buffer 2. 0 μ L,dNTPs1. 6μ L,Mg2+1. 2μ L,DNA 模板l.OyL，上游引物f2 0. 5yL,下游引物r2 0. 5yL,rTaq 酶0· 2 μ L，ddH2013. OyL;扩增程序为 94°C，5min ；94°C，30s，58°C，30s，72°C，30s ；30 个循环； 72°C，5min ； 10°C保温； 扩增得到第二段序列；3)PCR扩增获得第三段序列以步骤2)的产物为模板，以上游引物f3和下游引物r3进行PCR扩增；扩增体系为，每20 μ L中含有10XPCR buffer 2. 0 μ L,dNTPs1. 6μ L,Mg2+1. 2μ L,DNA 模板l.OyL，上游引物f30. 5yL,下游引物r30. 5yL,rTaq 酶0· 2 μ L，ddH2013. OyL;扩增程序为 94°C，5min ；94°C，30s，58°C，30s，72°C，30s ；30 个循环； 72°C，5min ； 10°C保温； 扩增得到第三段序列；4) PCR扩增获得目的基因序列以步骤3)的产物为模板，以上游引物f4和下游引物r4进行PCR扩增； 扩增体系为，每20 μ L中含有 10XPCR buffer 2. 0 μ L，MgDNA模板 上游引物f4 下游引物r4 rTaq 酶 ddH90，1. 6 μ L, 1. 2μ L, 1. 0μ L, 0. 5μ L, 0. 5μ L, 0. 2μ L, 13. 0μ L ；扩增程序为 94°C，5min ；94°C，30s，59°C，30s，72°C，30s ；30 个循环； 72°C，5min ； 10°C保温； 扩增得到目的基因序列；将扩增产物目的基因序列在琼脂糖凝胶上分离、回收和纯化，得到纯化的回收产物；5)连接和转化①回收产物连接到PMD-18T反应体系如下pMD-18T载体1 μ L，IOX连接酶缓冲液1 μ L，T4DNA连接酶350U，回收 PCR产物加至终反应体积IOyL;16°C连接12小时，得到连接产物；②转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞的制备a.取在无抗生素平板上生长良好的单个DH5α菌落，接种于Iml LB液体培养基中， 37°C、225r/min振荡培养过夜；b.取500μ L活化过夜的菌液于50mL LB液体培养基中，37°C振荡培养至0D600 = 0. 4 ；c.将菌液倒入50mL离心管中，冰浴IOmin；d.在预冷至4°C的离心机中，4000r/min离心IOmin后去掉上清液，收集菌体；e.加入20mL冰冷的0.lmol/L CaCl2于离心管中，均勻悬浮菌体后，冰浴中30min ；f.4°C下，4000r/min离心IOmin后去掉上清液，收集菌体，加入2mL冰冷的0. Imol/ LCaCl2溶液均勻悬浮菌体后，放入冰中待用；转化步骤如下a.将连接产物加入200μ L感受态细胞中，充分混勻置于冰上30min ；b.42°C热击lmin 30s，冰浴2min后加入预热至37°C的LB液体培养基600 μ L ；c.37°C>100r/min 低速振荡培养 50min ；d.在每个含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上加100μ L菌液，均勻涂于平板上；e.37°C培养箱中培养16小时；6)阳性克隆的筛选以前述步骤4)得到的目的基因序列为模板，以下述引物f5和r5扩增全长目的基因序列f5 :CCTGCTCAAATGGGAATA, r5 :AACGAATGACGCTACTGC ；①挑取培养基平板上生长良好的单菌落，在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中37°C、 225r/min振荡培养12小时；②以菌液为模板进行PCR扩增，反应体系如下 扩增体系为，每20 μ L中含有10XPCR buffer2. 0 μ L,dNTPs1. 6μ L,Mg2+1. 2μ L,DNA 模板l.OyL，上游引物f50. 5yL,下游引物r50. 5yL,rTaq _0. 2 μ L,ddH2013. OyL;③PCR反应扩增程序为 94°C，5min ；94°C，30s，58°C，30s，72°C，30s ；30 个循环； 72°C，5min ； 10°C保温；将得到的扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳分离；④测序通过测序确定扩增得到的序列与目的基因序列是否一致； B.构建含正向序列的中间载体pSK-int-F3031)PCR扩增获得正向片段以上述步骤A6)得到的目的基因序列为模板，设计上下游引物Fl和R1，其5’端分别引 入限制性内切酶位点XhoI和Hindlll，酶切位点外侧添加三个保护碱基以保证酶切完全； 引物序列如下F1 :5，ATCCTCGAGCCTGCTCAAATGGGAAT 3，， R1 5' CTCAAGCTTAACGAATGACGCTACTGC 3'；PCR扩增体系为，每20 μ L中含有10XPCR缓冲液2. 0 μ L, DNA 1-lOng, dNTPs ΙΟΟμπιοΙ/L，上游引物 Fl 5pmol，下游引物 Rl 5pmol, TaqDNA 聚合酶 1U，Mg2+L 5mmol/L， ddH20加至终体积20 μ L ；PCR 反应程序为先 94°C 4min;再 94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s，循环 30 次；最后 72°C 延伸 5min ；将扩增得到的产物在琼脂糖凝胶上电泳分离，得到正向片段PCR产物；2)PCR产物与中间载体的酶切、回收和纯化①PCR产物30 μ L酶切体系为=IOXH缓冲液3. 0 μ L,正向片段PCR产物10. OyL,...
【专利技术属性】
技术研发人员：付凤玲，李晚忱，张志勇，蒋晓芳，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：90[]
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