基于RPA-CRISPR/Cas13d的猪细小病毒2型检测方法、试剂盒及其应用技术

本发明专利技术提供了基于RPA‑CRISPR/Cas13d的猪细小病毒2型检测方法、试剂盒及其应用，属于生物学诊断技术领域，检测方法具体包括如下步骤：步骤1：使用带有T7启动子的RPA引物对样本DNA进行重组酶聚合酶扩增，得到扩增产物；步骤2，将步骤1的扩增产物通过T7体外转录为靶标ssRNA；将所述靶标ssRNA、Cas13d蛋白、crRNA和荧光标记的ssRNA报告分子混合，Cas13d蛋白与crRNA形成的复合体识别并切割所述靶标ssRNA，附带切割活性切割ssRNA荧光报告分子；步骤3：通过荧光信号变化判定PPV2的存在。本发明专利技术简便高效，无需大型设备，适合现场快速操作，为PPV2检测提供了一种新的技术途径。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物学诊断，具体涉及基于rpa-crispr/cas13d的猪细小病毒2型检测方法、试剂盒及其应用。

技术介绍

1、猪细小病毒(porcineparvovirus,ppv)是一种无囊膜、单链线状dna病毒，基因组大小约为5kb，主要引起母猪繁殖障碍，尤其是初产母猪流产。ppv病毒归属于细小病毒科(parvoviridae)，细小病毒亚科(parvovirussubfamily)，细小病毒属(parvovirusgenus)。

2、自1967年首次报道ppv以来，临中共发现8种血清型(ppv1–ppv8)。ppv2能够感染所有猪种，如果母源抗体存在，仔猪和断奶仔猪的感染率将低于育肥猪，其中母源抗体起着重要作用。

3、目前，中国已检测到所有ppv血清型。2001年，ppv2在缅甸猪血清中被偶然现。十年后，在中国，有“高热病”病史的猪场中再次发现该病毒，这些猪场曾感染猪呼吸与繁殖综合征病毒(prrsv)和断奶后多系统衰竭综合征(pmws)。随后，猪细小病毒2型(ppv2)在欧洲、韩国、墨西哥等地区相继被检测到。

本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.基于RPA-CRISPR/Cas13d的猪细小病毒2型检测方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的基于RPA-CRISPR/Cas13d的猪细小病毒2型检测方法，其特征在于：所述T7启动子序列为5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’，所述引物的长度为30-35个碱基，GC含量为40％-60％，扩增产物大小为100-300bp。

3.根据权利要求1所述的基于RPA-CRISPR/Cas13d的猪细小病毒2型检测方法，其特征在于：所述crRNA的序列选自crRNA1、crRNA2或crRNA3中的一种，其中：

4.根...

【技术特征摘要】

1.基于rpa-crispr/cas13d的猪细小病毒2型检测方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的基于rpa-crispr/cas13d的猪细小病毒2型检测方法，其特征在于：所述t7启动子序列为5’-taatacgactcactataggg-3’，所述引物的长度为30-35个碱基，gc含量为40％-60％，扩增产物大小为100-300bp。

3.根据权利要求1所述的基于rpa-crispr/cas13d的猪细小病毒2型检测方法，其特征在于：所述crrna的序列选自crrna1、crrna2或crrna3中的一种，其中：

4.根据权利要求1所述的基于rpa-crispr/cas13d的猪细小病毒2型检测方法，其特征在于：ssrna荧光报告分子序列为5’-fam-uuuuuu-bhq1-3’，5’端连接荧光基团fam，3’端连...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐雷，杨旭，陶倩，王彤萱，江地科，赵军，蒋红丽，鲁志平，邬旭龙，
申请(专利权)人：成都农业科技职业学院，
类型：发明
国别省市：