回收叶蛋白的新方法技术

本申请描述了处理可溶性植物叶蛋白的新方法。尽管叶蛋白被认为可能是自然界最丰富的蛋白源，但叶蛋白的有效加工技术的缺乏限制了其商业应用。本申请所描述的方法提供了适用于工业化规模叶蛋白生产的从植物中提取和纯化叶蛋白的手段。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本申请的专利技术涉及从植物叶中获取蛋白，以用于食品和工业产品 的新方法。
技术介绍
叶蛋白可能是世界上最廉价且最丰富的蛋白源(Wikipedia, 2008a, Pirie, 1987)。(说明书的结尾处包括了本文所提及的这些及所有参考 文献的全部出处)。其同样非常有营养价值，具有许多令人想要的使 其可用于食品和工业产品的功能特性。本专利技术公开内容中所使用的术语叶蛋白意指植物叶中所含有 的所有水溶性蛋白。众所周知，所有己知的含叶绿素植物中都存在着 可溶性叶蛋白。本专利技术具体涉及可溶性叶蛋白。植物叶中的可溶性蛋白约有一半由rubisco(核酮糖-l,5-二磷 酸(RUBP)羧化酶/加氧酶或RuBisCO)组成(Johal， 1982)。所有 已知绿色植物中都存在的Rubisco似乎是最丰富的叶蛋白，并且可能是 地球上最丰富的蛋白(Wikipedia, 2008b) 。 Rubisco是植物中催化RUBP羧化和氧合，g卩，光合作用和光呼吸的关键反应的酶(Tso， 1990)。 Rubisco是级分1蛋白的主要成分，术语级分1蛋白由Wildman (1983)提出，是指可以在叶蛋白加工过程中结晶出来的可溶性叶蛋 白的一部分。Rubisco具有与乳蛋白酪蛋白相当的营养价值(Wildman， 1983)。 研究显示，rubisco的蛋白效率比(PER，即增加的体重/消耗的蛋白质) 显著高于酪蛋白或卵蛋白(Tso, 2006) 。 Tornatzky (等，1996)报道， rubisco似乎适于肾透析患者及其它身体不能产生足够蛋白的人们，这 部分缘于rubisco结晶可以洗净盐(Tornatzky等，1996)的事实。Rubisco还具有优良的粘合，胶凝，发泡，搅拌和乳化特性(Wildman, 1983; Sheen 1991)。此外，rubisco无色无味无臭，这使其在加入食品 或工业产品方面具有吸引力(Wildman, 1983) 。 Rubisco相对稳定，其 可以结晶形式运输或生产为粉末(Tomatzky等，1996)。考虑到这些 令人想要的营养及功能特性，mbisco适合加入到各种各样的食品和非 食物产品中，用于如营养补剂，粘合剂或乳化剂的目的。事实上， Wildman ( 1983)称，rubisco的功能特性与卵白蛋白或酪蛋白相似。剩余的一半可溶性叶蛋白不像级分1蛋白那样容易结晶。有时， 这些蛋白被称作级分2蛋白(Wildman， 1983)，但这个术语过去 常常用来描述那些在叶蛋白加工过程中不结晶的可溶性蛋白。然而， 这些蛋白具有许多与rubisco相同的有益特征。其具有与酪蛋白相当的 PER和营养品质(Tso, 2006; Wildman, 1983)。和rubisco—样，它们 都无色无味(Tso, 2006)。它们也是水溶性的(Wildman, 1983)。通 过适当的提取法，级分2蛋白可以表现出与rubisco相同的功能特性， 并且具有相同的商业应用(Wildman, 1983)。所谓的级分1和级 分2蛋白都是色素结合蛋白(pigment-bound蛋白)。叶蛋白的潜在产量非常大。Wildman (1983)报道，烟草的叶蛋白产量为总植物固体干物质的6%。在我们自己用烟草作叶蛋白源的田间试验中，我们从一种含生物碱较少的马里兰烟草品种MD 609 LA获得 了占总叶干重的约13%的粗蛋白产量。当我们种植烟草用于回收叶蛋 白时，我们的年平均生物质产量超过6干吨/英亩。由于叶代表了这种 总生物质的约一半，因此我们设计的叶蛋白产量为约800磅/英亩。Pirie可能是第一位在20世纪40年代认真地提出将叶蛋白用作营 养源的人(Pirie， 1942， 1987)。然而，由Pirie开发的蛋白提取方法产 生的绿色蛋白制品，具有使其不适合人类食用的气味，味道和质地(推 测是由于没有充分去除叶绿素的缘故)(Wildman, 1983)。20世纪70年代，USDA西区研究中心(USDA Regional Research Center)的研究者们将Pirie开发的技术进行了修改和改良，用其从苜 蓿中生产叶蛋白浓縮物，并命名为Pro-Xan。在该工艺的晚期版本 中，可溶性蛋白经加热凝固，得到含90%蛋白的灰白色淡而无味的物 质(Wildman， 1983) 。 Wildman ( 1983)报道，该所得蛋白中的rubisco 与级分2蛋白一起都发生了变性，并失去了其功能特征。20世纪80年代早期，Wildman ( 1983)禾卩Wildman及Kwanyuen (1981)开发出一种用于从烟草叶中提取rubisco的技术，该技术依赖 于焦亚硫酸钠的应用。新收割的烟草植物的地上部分在倒入成浆设备 中时，用0.5%焦亚硫酸钠溶液喷雾。将浆料置于螺旋压力机中，得到 含有可溶性蛋白的绿色汁液。将该绿色汁液泵入热交换器中，迅 速加热至约125。F。然后汁液迅速冷却至室温。Wildman称，这种急剧的温度变化有助于粘附绿色色素和其它类脂化合物的颗粒物聚集。然 后绿色汁液进入连续流离心机，除去淀粉和85%的绿色颗粒物。从离 心机里出来的是含有可溶性蛋白的部分澄清的褐色汁液。然后，该部 分澄清的褐色汁液泵入回转真空过滤器中，除去最后的微量绿泥。从 过滤器中出来的褐色澄清汁液然后送至贮槽，在那里，rubisco蛋白在 储存的3-6 h内开始结晶，并在结晶开始后的3-4 h内完成结晶。Wildman报道，为了使级分2蛋白沉淀，他向pH4的母液中加入了酸，但同时指出，这并不是一个好的方法，因为其导致了蛋白的变性。Bourque ( 1982)开发了一种使rubisco结晶的方法，包括将级分1 蛋白溶液与pH值通常为4.8-7.2的沉淀剂溶液混合，产生最终pH值为 6.6-7.0的蛋白溶液与沉淀剂溶液的混合溶液，这导致了级分1蛋白的 结晶。Bourque提到，蛋白溶液可以通过先前文献中所描述的级分1植物 蛋白标准纯化工艺获得。例如，他写道，可以在高盐(即，l.OMNaCl) 缓冲液中将叶匀浆化，过滤匀浆，以除去较大的固体，然后离心，得 到含有可溶性蛋白的上清液，用低盐缓冲液(即，0.2MNaCl)交换高 盐缓冲液，然后在柱上用低盐缓冲液洗脱蛋白溶液，接着加入沉淀剂， 如硫酸铵沉淀蛋白，以产生30-50%的沉淀剂饱和溶液。然后，所得沉 淀可以用Bourque所公开的技术结晶。Bourque报道，他的专利技术适用于 烟草，玉米，马铃薯，番茄或苜蓿的新鲜叶子。Johal (1982， 1983和1986)开发出一种使rubisco结晶纯度超过 90%的技术。在该技术中，叶子首先在浓度为0.05M - 0.2M的含有 tris-HCL或磷酸盐或硼酸盐的缓冲溶液中匀浆化。缓冲溶液的pH值范 围为7.8-8.25，最佳pH值为8.2左右。加入聚乙二醇至最高占溶液的 15%。上清液在约4。C冷却。Johal ( 1982)报道，加入氯化镁能增加结 晶收率。Johal报道，他的技术已经用多种物种，包括烟草，苜蓿，黑 麦草，番茄和菠菜证明是成功的。DeJong ( 1982)报道了用于制备叶蛋白浓縮物的凝固法。经物理 浸渍过的叶子先用交联本文档来自技高网...

【技术保护点】
从植物叶回收可溶性叶蛋白的方法，该方法自始至终在约０℃至约２５℃的温度下进行，包括以下步骤：　（ａ）在缓冲溶液存在下，将含有可溶性蛋白的植物叶的细胞壁破碎，以使破碎的叶的物质和可溶性叶蛋白暴露于缓冲溶液中，并且使叶蛋白溶解在其中，其中缓冲 溶液（ｉ）浓度为０．０２５Ｍ－０．３Ｍ；（ｉｉ）以大于１∶１的缓冲液与叶的比存在；（ｉｉｉ）ｐＨ值与可溶性叶蛋白的等电点相差至少一个ｐＨ单位，并且与破碎的叶的物质的ｐＨ值相差在两个ｐＨ单位以内；（ｉｖ）具有在（ｉｉｉ）的ｐＨ值内有效的缓冲区域；以及（ｖ）任选地包括螯合剂和／或还原剂，　（ｂ）在可溶性叶蛋白保持溶解在缓冲溶液中的条件下，除去基本上所有的纤维素物质；　（ｃ）在可溶性叶蛋白保持溶解在缓冲溶液中的条件下，除去大多数植物叶绿体物质；以及　（ｄ）干燥缓冲溶液中溶解的 叶蛋白。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2007-5-16 60/938,2671.从植物叶回收可溶性叶蛋白的方法，该方法自始至终在约0℃至约25℃的温度下进行，包括以下步骤(a)在缓冲溶液存在下，将含有可溶性蛋白的植物叶的细胞壁破碎，以使破碎的叶的物质和可溶性叶蛋白暴露于缓冲溶液中，并且使叶蛋白溶解在其中，其中缓冲溶液(i)浓度为0.025M-0.3M；(ii)以大于1∶1的缓冲液与叶的比存在；(iii)pH值与可溶性叶蛋白的等电点相差至少一个pH单位，并且与破碎的叶的物质的pH值相差在两个pH单位以内；(iv)具有在(iii)的pH值内有效的缓冲区域；以及(v)任选地包括螯合剂和/或还原剂，(b)在可溶性叶蛋白保持溶解在缓冲溶液中的条件下，除去基本上所有的纤维素物质；(c)在可溶性叶蛋白保持溶解在缓冲溶液中的条件下，除去大多数植物叶绿体物质；以及(d)干燥缓冲溶液中溶解的叶蛋白。2. 权利要求1的方法，其中在步骤(a)中，叶的细胞壁通过将叶 切碎，磨碎，碾碎或压碎，成浆，浸渍程序，机械压力，辊子或匀浆 化破碎。3. 权利要求1的方法，其中在步骤(a)后，破碎的植物细胞壁在 缓冲溶液中保持长达24小时。4. 权利要求3的方法，其中破碎的植物细胞壁在环境温度或低于 环境温度的温度下保持在缓冲溶液中。5. 权利要求l的方法，其中缓冲溶液是适于蛋白提取的系统，其 选自以下组合磷酸氢二钠和磷酸二氢钾(Na2HP04-KH2P04)，磷酸 二氢钾/氢氧化钠，氢氧化钠/柠檬酸，乙酸/乙酸铵，氢氧化钾/磷酸二氢钾，柠檬酸/磷酸氢二钠，磷酸二氢钾/磷酸氢二钾，邻苯二甲酸氢钾/氢氧化钠，碳酸钾/四硼酸钾/氢氧化钾/EDTA二钠二水合物，giordano 缓冲液，乙酸钠三水合物/氯化钠，三(羟甲基)氨基甲垸(Tris)， EDTA/Tris/HCl， 2-氨基-2-(羟甲基)-l，3-丙二醇/Tris， Tris/EDTA，氯化 铵/氢氧化铵，HEPES/NaCl，咪唑，磷酸盐，N-吗啉基丙磺酸(MOPS)， N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)，三乙醇胺，和N-三(羟 甲基)-甲基-甘氨酸(Tricine)。6. 权利要求1的方法，其中螯合剂选自EDTA， EGTA， HEDTA， DTPA， NTA，柠檬酸钙，二乙酸钙，六偏磷酸钙，柠檬酸，葡糖酸， 磷酸氢二钾，磷酸氢二钠，异丙基柠檬酸盐，磷酸二氢钙， 一异丙基 柠檬酸盐，柠檬酸钾，磷酸二氢钠，柠檬酸钠，葡糖酸钠，六偏磷酸 钠，偏磷酸钠，磷酸钠，焦磷酸钠，三聚磷酸钠，硬脂酰柠檬酸盐， 焦磷酸四钠，乙二胺四乙酸钙二钠，葡萄糖酸-S-内酯，葡萄糖酸钾等， 以及其类似物，同系物和衍生物。7. 权利要求1的方法，其中还原剂选自2-巯基乙醇，2-巯基乙胺 -HCL，半胱氨酸-HCL，埃尔曼试剂，BME， DTT，谷胱甘肽，半胱氨 酸，三(2-羧乙基)膦盐酸盐，TCEP 二硫化物，N-乙基马来酰亚胺， TCEP-HCL，亚铁离子，氢化铝锂(LiAlH4)，初生态氢，钠汞齐，硼 氢化钠(NaBH4)，亚锡离子，亚硫酸盐化合物，肼，锌汞齐(Zn(Hg))， 二异丁基氢化铝，林德拉催化剂，草酸(C2H204) ， 二硫赤藓糖醇， 巯基乙酸盐，谷胱甘肽，半胱氨酸，抗坏血酸盐，以及其类似物，同 系物和衍生物。8. 权利要求1的方法，其中在步骤(b)中，纤维素物质用螺旋 压力机，纤维过滤器，飞轮式螺旋压力机，搅拌器，机械压力机，机 械脱水装置或破碎机去除。9. 权利要求1的方法，其中在步骤(c)中，叶绿体物质用离心机或真空过滤器去除。10. 权利要求1的方法，其中在步骤(...

【专利技术属性】
技术研发人员：马丁罗，傅红，
申请(专利权)人：马里兰大学，大学城，
类型：发明
国别省市：US[美国]