【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及全麻机制的中枢调控领域，尤其涉及一种全身麻醉觉醒和精神奖赏副作用的神经中枢调控实验方法。
技术介绍
1、丙泊酚是目前为止临床上使用最广泛的全身静脉麻醉药物之一，符合快速诱导、镇静并维持手术条件、能在体内快速代谢以便手术结束时患者可以尽快恢复意识即觉醒状态，对维护患者健康和医学发展有重大意义。虽然至今丙泊酚的麻醉机制还未完全明确，但丙泊酚麻醉作用与调节精神奖赏作用的中脑边缘系统有关联。伏隔核（nac）作为麻醉药麻醉时产生脑电爆发抑制的脑区之一，也是奖赏环路的重要节点。该脑区的多巴胺能受体1（d1r）神经元是参与nac与vta间投射的重要中间神经元。
2、丙泊酚诱发小鼠产生条件位置偏爱现象（conditioned place preference，cpp）。与其他已知的成瘾物质类似，重复使用丙泊酚容易出现精神奖赏，其滥用现象逐年增多。滥用丙泊酚比滥用其他成瘾性药物更易出现使用过量导致死亡。有报道发现滥用丙泊酚致死人群中81%为用药过量意外死亡。丙泊酚滥用人群中医务人员占86%，而且一项调查显示麻醉医生滥用药物致死情况中高达45%与滥用丙泊酚有关。本研究组前期研究已通过建立大鼠静脉自身给药模型和环境线索诱导的复吸模型，在动物模型上验证了丙泊酚具有精神奖赏作用，且发现与中脑边缘系统nac d1r和erk信号通路以及腹侧被盖区（ventraltegmental area，vta）有关，拮抗nac d1r减少大鼠丙泊酚自身给药行为，但不影响大鼠活动和自由摄食的剂量。有学者发现激活nac d1r神经元可以诱导和维持觉
3、但是，现有技术中，对于激活nac d1r神经元能否促进丙泊酚麻醉觉醒和丙泊酚麻醉过程中抑制nac d1r神经元能否减弱麻醉觉醒后的精神奖赏作用的研究还处于空白。
4、为此，本专利技术提出一种全身麻醉觉醒和精神奖赏副作用的神经中枢调控实验方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种全身麻醉觉醒和精神奖赏副作用的神经中枢调控实验方法。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
3、一种全身麻醉觉醒和精神奖赏副作用的神经中枢调控实验方法，包括以下步骤：
4、s1：将小鼠作为实验对象，并将小鼠随机等分为两大组，每大组随机等分为6小组；
5、s2：伏隔核（nucleus accumbens，nac）脑区多巴胺1受体（dopamine 1 receptor，d1r）腺相关病毒（adeno-associated virus，aav）载体注射及表达；
6、s3：载体表达的离体电生理检测，在aav载体表达好后，进行nac脑片膜片钳验证载体的表达，检验给予cno时转染化学遗传载体的nac区d1r神经元电生理活动的变化，以及光刺激时转染光遗传学载体的nac区d1r神经元电生理活动的改变；
7、s4：单次丙泊酚麻醉小鼠模型的建立，建立单次丙泊酚麻醉小鼠模型；
8、s5：长时激活nac d1r神经元调控丙泊酚麻醉觉醒；
9、s6：短时激活nac d1r神经元调控丙泊酚麻醉觉醒；
10、s7：建立小鼠cpp模型；
11、s8：长时抑制nac d1r神经元调控丙泊酚麻醉觉醒后精神奖赏副作用；
12、s9：短时抑制nac d1r神经元调控丙泊酚麻醉觉醒后精神奖赏副作用。
13、优选地：所述s1步骤中，十二组分别为：
14、veh che a组，其为化学遗传学空载对照组，其处理条件为dio-eyfp +脂肪乳+生理盐水；
15、pro a l组，其为l丙泊酚麻醉组，其处理条件为dio-eyfp +丙泊酚+生理盐水；
16、pro a l+ che组，其为长期激活觉醒组，其处理条件为dio-hm3d+丙泊酚+cno；
17、veh opt a组，其为光遗传学空载对照组，其处理条件为dio-mcherry +脂肪乳+无光照；
18、pro a s组，其为s丙泊酚麻醉组，其处理条件为dio-mcherry +丙泊酚+无光照；
19、pro a s+ opt组，其为短期激活觉醒组，其处理条件为dio-hchr2+丙泊酚+光激活；
20、veh che c组，其为化学遗传学空载对照组，其处理条件为dio-eyfp +脂肪乳+生理盐水；
21、pro c l组，其为l丙泊酚cpp组，其处理条件为dio-eyfp +丙泊酚+生理盐水；
22、pro c l+ che组，其为长期抑制cpp组，其处理条件为dio-hm4d+丙泊酚+cno；
23、veh opt c组，其为光遗传学空载对照组，其处理条件为dio-mcherry +脂肪乳+无光照；
24、pro c s组，其为s丙泊酚cpp组，其处理条件为dio-mcherry +丙泊酚+无光照；
25、pro c s+ opt组 ，其为短期抑制cpp组，其处理条件为dio-enphr3.0 +丙泊酚+光抑制。
26、优选地：所述s2步骤的具体步骤为：
27、s21：将小鼠置于脑立体定位仪上，进行异氟烷气体麻醉，保温毯维持体温，剃毛、消毒；
28、s22：切开颅顶皮肤暴露颅骨，以前囟bregma作为立体定位的原点，通过调节门齿高度使后囟lambda与bregma水平；
29、s23：通过左右调平使矢状缝两侧等距离的位点处于同一水平面；
30、s24：在nac脑立体的双侧分别注射对应组别载体200 nl，留针10 min，nac脑立体定位坐标为：ap +1.4 mm，ml ±1.3mm，dv -4.2mm；
31、s25：其中，veh opt a组、pro a s组、pro a s+ opt组以及veh opt c组、pro c s、pro c s+ opt组，在比注射深度浅0.5 mm处置入光纤，同时埋植两个固定颅钉，牙科水泥覆盖固定，未留置光纤组小鼠缝合皮肤；
32、s26：单笼饲养，转染表达三周。
33、优选地：所述s3步骤，其包括以下步骤：
34、s31：制备膜片钳电极，记录电极阻抗位于6～8mω；
35、s32：取每组的部分小鼠，麻醉后冰浴上快速取脑本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种全身麻醉觉醒和精神奖赏副作用的神经中枢调控实验方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种全身麻醉觉醒和精神奖赏副作用的神经中枢调控实验方法，其特征在于，所述S1步骤中，十二组分别为：
3.根据权利要求1所述的一种全身麻醉觉醒和精神奖赏副作用的神经中枢调控实验方法，其特征在于，所述S2步骤的具体步骤为：
4.根据权利要求1所述的一种全身麻醉觉醒和精神奖赏副作用的神经中枢调控实验方法，其特征在于，所述S3步骤，其包括以下步骤：
5.根据权利要求1所述的一种全身麻醉觉醒和精神奖赏副作用的神经中枢调控实验方法，其特征在于，所述S4步骤中，小鼠转染表达好载体后，按组别给予140 mg·kg-1，10mL·kg-1 i.p.的丙泊酚，即刻进行翻正反射消失（loss of righting reflex，LORR）评分，间隔15 s评分一次，并记录开始注射丙泊酚的时间和觉醒时间，LORR评分标准为：
6.根据权利要求5所述的一种全身麻醉觉醒和精神奖赏副作用的神经中枢调控实验方法，其特征在于，所述S5步骤包括
7.根据权利要求1所述的一种全身麻醉觉醒和精神奖赏副作用的神经中枢调控实验方法，其特征在于，所述S6步骤中，其包括以下步骤：
8.根据权利要求1所述的一种全身麻醉觉醒和精神奖赏副作用的神经中枢调控实验方法，其特征在于，所述S7步骤中，每次进行CPP操作前，提前1 h把小鼠连同饲养笼放置于CPP测试间，并在行为学进行时，保证打开饲养笼盖连同把小鼠置于CPP箱内的时间少于60 s，每次实验操作时都盖好顶部的通气孔隔声板，每只小鼠适应或测试完毕后，用抹布蘸水清洁箱内底部和侧壁并更换触觉垫板下的垫纸；
9.根据权利要求1所述的一种全身麻醉觉醒和精神奖赏副作用的神经中枢调控实验方法，其特征在于，所述S8步骤中，其包括以下步骤：
10.根据权利要求1所述的一种全身麻醉觉醒和精神奖赏副作用的神经中枢调控实验方法，其特征在于，所述S9步骤，其包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种全身麻醉觉醒和精神奖赏副作用的神经中枢调控实验方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种全身麻醉觉醒和精神奖赏副作用的神经中枢调控实验方法，其特征在于，所述s1步骤中，十二组分别为：
3.根据权利要求1所述的一种全身麻醉觉醒和精神奖赏副作用的神经中枢调控实验方法，其特征在于，所述s2步骤的具体步骤为：
4.根据权利要求1所述的一种全身麻醉觉醒和精神奖赏副作用的神经中枢调控实验方法，其特征在于，所述s3步骤，其包括以下步骤：
5.根据权利要求1所述的一种全身麻醉觉醒和精神奖赏副作用的神经中枢调控实验方法，其特征在于，所述s4步骤中，小鼠转染表达好载体后，按组别给予140 mg·kg-1，10ml·kg-1 i.p.的丙泊酚，即刻进行翻正反射消失（loss of righting reflex，lorr）评分，间隔15 s评分一次，并记录开始注射丙泊酚的时间和觉醒时间，lorr评分标准为：
6.根据权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：苏颖，
申请(专利权)人：温州医科大学附属第二医院温州医科大学附属育英儿童医院，
类型：发明
国别省市：
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