一种黄嘌呤氧化酶的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种黄嘌呤氧化酶的制备方法，属于分子生物学技术领域。本发明专利技术提供了一种黄嘌呤氧化酶的制备方法，以假单胞菌为宿主菌，将xdhA、xdhB和xdhC三个基因导入所述宿主菌的基因组中，并通过共表达的方法完成黄嘌呤脱氢酶的表达，而后利用巯基特异性修饰剂处理黄嘌呤脱氢酶，生产得到黄嘌呤氧化酶。本发明专利技术通过重组假单胞菌发酵制备黄嘌呤氧化酶的前体物质，实现了在假单胞菌中的高效表达，表达产物纯化后比活力为100.3U/mg，并经巯基特异性修饰剂处理后可用于工业化生产应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学，具体涉及一种黄嘌呤氧化酶的制备方法。

技术介绍

1、黄嘌呤氧化还原酶(xanthine oxidoreductase，简称xor)是一种氧化还原酶，它具有黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，简称xod，ec 1.17.3.2)和黄嘌呤脱氢酶(xanthinedehydrogenase，简称xdh，ec 1.17.1.4)两种不同的存在形式。黄嘌呤氧化酶主要催化次黄嘌呤氧化生成黄嘌呤，进一步氧化黄嘌呤生成尿酸。

2、目前，市场上广泛采用的xor为xod，主要从牛奶中提取，牛奶黄嘌呤氧化酶是目前市场上主要的商业化产品，也是最早在市场上公开专利的酶，其他商品化xor主要包括kikkoman company生产的e.cloacae xod和toyobo company提供的a.luteus xod。xod具有很高的商业价值，在临床诊断、药物合成、食品及环境保护等领域有广泛应用。然而，随着应用领域的不断扩展，商品化xod仍然面临着酶种类少、酶催化活性不高、生产效率低下的问题。因此，xod大规模低成本生产方法的研究可以本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种黄嘌呤氧化酶的制备方法，其特征在于，包括将xdhA、xdhB和xdhC三个基因导入假单胞菌的基因组中，并在所述假单胞菌中共表达，表达产物中包含黄嘌呤脱氢酶；

2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述xdhA、xdhB和xdhC三个基因的来源包括铜绿假单胞菌PAO1。

3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，来源于铜绿假单胞菌PAO1的三个基因xdhA、xdhB和xdhC的核苷酸序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.3所示。

4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，将所述xdhA、xdhB和xdhC三个基因导入所述假单...

【技术特征摘要】

1.一种黄嘌呤氧化酶的制备方法，其特征在于，包括将xdha、xdhb和xdhc三个基因导入假单胞菌的基因组中，并在所述假单胞菌中共表达，表达产物中包含黄嘌呤脱氢酶；

2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述xdha、xdhb和xdhc三个基因的来源包括铜绿假单胞菌pao1。

3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，来源于铜绿假单胞菌pao1的三个基因xdha、xdhb和xdhc的核苷酸序列如seq id no.1～seq id no.3所示。

4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，将所述xdha、xdhb和xdhc三个基因导入所述假单胞菌的基因组时，首先将扩增得到的包含xdha和xdhb基因的片段插入表达载体中，构建得到第一表达载体；将扩增得到的xdhc基因插入第一表达载体中，构建得到第二表达载体，利用第二表达载体转化铜绿假单胞菌pao1，构建得到共表达重组假单胞菌。

5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述包含xdha和xdhb基因的片段的扩增引物包括xdhab-f和xdhab-r，所述xdhab-f的核苷酸序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：周健强，朱荫华，卞金玉，
申请(专利权)人：嘉浦添成上海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：