【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及病毒检测，尤其涉及一种sars-cov-2假病毒载体构建验证方法。
技术介绍
1、目前，新型冠状病毒(sars-cov-2)的检测方法主要依赖于核酸检测，特别是实时荧光定量pcr(rt-qpcr)。这一检测方法利用病毒的特定基因序列作为靶标，如n基因、e基因和orf1a/b基因，进行扩增和检测。现有的核酸检测技术具有高度的灵敏度和特异性，已经在全球范围内广泛应用于新冠病毒的诊断。
2、但现有新型冠状病毒(sars-cov-2)的检测方法在实际应用中，真实的病毒样本具有高度传染性，实验室操作存在较高的生物安全风险。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种sars-cov-2假病毒载体构建验证方法，旨在解决真实的新型冠状病毒样本具有高度传染性，实验室操作新型冠状病毒的检测存在较高的生物安全风险的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了一种sars-cov-2假病毒载体构建验证方法，包括以下步骤：
3、基于新型冠状病毒选定3个靶标基因，将3个所述靶标基因的核苷酸序列串联，并克隆至慢病毒包装表达载体上，得到质粒；
4、将所述质粒与二代慢病毒包装质粒转化大肠杆菌克隆菌株，扩大培养，提取无内毒素质粒；
5、基于额定比例将所述无内毒素质粒共转染细胞，96小时后从所述转染细胞上清液中收集含有目的基因rna的假病毒颗粒；
6、使用聚乙二醇8000溶液对所述假病毒颗粒进行沉淀，弃掉细胞上清液后，使用病毒溶
7、基于所述无内毒素质粒分别对3个所述靶标基因绘制标准曲线，对所述假病毒颗粒进行rna提取、逆转录和荧光定量pcr，通过所述标准曲线计算假病毒滴度，得到假病毒。
8、其中，所述新型冠状病毒选定3个靶标基因包括n基因、e基因和orf1a/b基因。
9、其中，所述将所述质粒与二代慢病毒包装质粒转化大肠杆菌克隆菌株，扩大培养，提取无内毒素质粒的具体方式：
10、从-80℃超低温冰箱取出大肠杆菌trans10克隆菌株，置于冰上融化，加入1μl质粒，使用枪头轻轻吹打混匀，冰浴30min；
11、42℃的条件下热激45s，转移至冰浴2min；
12、加入500μl不含抗生素的lb培养基，在37℃的条件下，搅拌220rpm，培养30min；
13、在超净工作台中，取50μl菌液滴加到lb平板上，用涂布棒均匀涂开将平板放入37℃培养箱中，待菌液干后倒置培养过夜；
14、在平皿上挑取一个大小合适、边缘圆滑的单菌落至5ml lb培养基试管中，在37℃的条件下，搅拌180rpm，培养12h；
15、使用高纯度质粒小提试剂盒进行高纯度质粒提取，获取无内毒素质粒，琼脂糖凝聚电泳检测所述无内毒素质粒纯度以及形式，检测后，将所述无内毒素质粒放于-20℃备用。
16、其中，所述使用聚乙二醇8000溶液对所述假病毒颗粒进行沉淀，弃掉细胞上清液后，使用病毒溶解液重悬浓缩的具体方式：
17、称取nacl 8.766g和聚乙二醇50g溶解在200ml超纯水中，并在121摄氏度条件下，湿热灭绝30min，保存在4℃的环境中待用，得到聚乙二醇8000溶液；
18、收集细胞上清，使用0.45μm滤头过滤细胞上清液；
19、每30ml过滤后的病毒初始液，加入所述聚乙二醇8000溶液7.5ml，每20～30min混合一次，共进行3-5次，并将混合液在4℃环境中放置过夜；
20、在4℃的条件下，取4000g所述混合液，离心20min；
21、吸弃上清，静置管子1～2分钟，吸走残余液体；
22、加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；
23、集中后的病毒悬液分装成50μl每份，保存在成品管中，用碎干冰速冻后储存在-80℃。
24、其中，所述假病毒最终获得滴度>10^8copies/ml。
25、本专利技术的一种sars-cov-2假病毒载体构建验证方法，基于新型冠状病毒选定3个靶标基因，将3个所述靶标基因的核苷酸序列串联，并克隆至慢病毒包装表达载体上，得到质粒；将所述质粒与二代慢病毒包装质粒转化大肠杆菌克隆菌株，扩大培养，提取无内毒素质粒；基于额定比例将所述无内毒素质粒共转染细胞，96小时后从所述转染细胞上清液中收集含有目的基因rna的假病毒颗粒；使用聚乙二醇8000溶液对所述假病毒颗粒进行沉淀，弃掉细胞上清液后，使用病毒溶解液重悬浓缩；基于所述无内毒素质粒分别对3个所述靶标基因绘制标准曲线，对所述假病毒颗粒进行rna提取、逆转录和荧光定量pcr，通过所述标准曲线计算假病毒滴度，得到假病毒，该方法筛选确认sars-cov-2检测靶标基因；构建带有检测目的基因的表达质粒；通过慢病毒包装系统转染hek293t细胞；经细胞培养后收集上清，获取含有靶标基因的假病毒；对假病毒进行纯化浓缩；通过荧光定量pcr进行假病毒滴度检测，由于假病毒不具有传染性，但其基因组与真实病毒相似，该方法可以安全地在实验室中使用，减少了操作中的生物安全风险，具有安全性，rna假病毒标准品可以作为质控品，用于评估核酸提取、逆转录和扩增等步骤的效率和准确性，确保检测方法的准确性和可靠性；通过定期使用标准品，可以监控检测过程中的变化，确保检测结果的稳定性和一致性；解决了真实的新型冠状病毒样本具有高度传染性，实验室操作新型冠状病毒的检测存在较高的生物安全风险的问题。
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1.一种SARS-CoV-2假病毒载体构建验证方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的一种SARS-CoV-2假病毒载体构建验证方法，其特征在于；
3.如权利要求1所述的一种SARS-CoV-2假病毒载体构建验证方法，其特征在于；
4.如权利要求1所述的一种SARS-CoV-2假病毒载体构建验证方法，其特征在于；
5.如权利要求1所述的一种SARS-CoV-2假病毒载体构建验证方法，其特征在于；
【技术特征摘要】
1.一种sars-cov-2假病毒载体构建验证方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的一种sars-cov-2假病毒载体构建验证方法，其特征在于；
3.如权利要求1所述的一种sars-cov-...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄为，唐文革，顾万江，孙全，赵华，王明月，谢武娟，
申请(专利权)人：重庆市疾病预防控制中心重庆市预防医学科学院，
类型：发明
国别省市：
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