一种外被体蛋白Ⅱ邻近标记载体的构建及其标记方法技术

本发明专利技术提供了一种外被体蛋白Ⅱ邻近标记载体的构建及其标记方法。本发明专利技术用将COPⅡ包被囊泡组分Sar1b蛋白与生物素连接酶BioID2融合表达，构建了外被体蛋白Ⅱ邻近标记载体，成功在PK‑15细胞上构建COPⅡ包被囊泡的邻近标记方法，用于标记COPⅡ的组分和货物蛋白。构建的高灵敏度的瞬时标记方法可以在不同细胞状态和试验条件下筛选COPⅡ标记蛋白，进而动态分析COPⅡ在时间和空间上的功能。本发明专利技术在PK细胞上成功获得COPⅡ包被囊泡的邻近标记方法，为探究COPⅡ与货物蛋白之间直接或间接的相互作用提供了有力的工具。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物，涉及一种外被体蛋白ⅱ邻近标记载体的构建及其标记方法。

技术介绍

1、在真核细胞中，细胞器之间的信息通讯和物质交换主要是由囊泡运输负责的。外被体蛋白ⅱ（coatomer proteinⅱ，copⅱ）包被的囊泡在内质网出口位点（er exit sites，eres）形成，介导从内质网（endoplasmicreticulum，er）到高尔基体（golgi apparatus，golgi）的顺行运输，其中eres是er上长期存在的亚结构域。copⅱ复合体由1个小gtp酶（即sar1）和2个异二聚体（即sec23/sec24和sec13/sec31）组成。gtp酶活性被激活后，sar1插入er膜使其弯曲，并招募sec23/sec24二聚体形成囊泡被膜的内层。sec24是copⅱ途径主要的调节分子，其通过识别货物中的特定分选信号捕获货物。sar1-sec23/sec24复合物形成初生的囊泡并招募sec13/sec31。sec13/sec31在囊泡外围形成一个笼状结构，从而维持了囊泡膜的曲率。sec13/sec31能使sar1 gtp酶失活，从而导本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种外被体蛋白Ⅱ邻近标记载体的构建方法，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的外被体蛋白Ⅱ邻近标记载体的构建方法，其特征在于：步骤（1）中，真核表达载体为pCDH-CMV-513B-1。

3.根据权利要求1所述的外被体蛋白Ⅱ邻近标记载体的构建方法，其特征在于：步骤（1）中，生物素连接酶BioID2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求1所述的外被体蛋白Ⅱ邻近标记载体的构建方法，其特征在于：步骤（1）中，生物素连接酶BioID2序列两端添加酶切位点和保护性碱基： N’-EcoRⅠ-BioID2-BamHⅠ-C’；然后将合成的目...

【技术特征摘要】

1.一种外被体蛋白ⅱ邻近标记载体的构建方法，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的外被体蛋白ⅱ邻近标记载体的构建方法，其特征在于：步骤（1）中，真核表达载体为pcdh-cmv-513b-1。

3.根据权利要求1所述的外被体蛋白ⅱ邻近标记载体的构建方法，其特征在于：步骤（1）中，生物素连接酶bioid2的核苷酸序列如seq id no.2所示。

4.根据权利要求1所述的外被体蛋白ⅱ邻近标记载体的构建方法，其特征在于：步骤（1）中，生物素连接酶bioid2序列两端添加酶切位点和保护性碱基： n’-ecorⅰ-bioid2-bamhⅰ-c’；然后将合成的目的片段和真核表达载体进行双酶切，酶切体系为10×quickcutbuffer 3.0μl，酶ⅰ1.5μl，酶ⅱ1.5μl，目的片段/载体1.0μg，加ddh2o至30μl，酶切程序为37℃，1.5h；

5.根据权利要求1所述的外被体蛋白ⅱ邻近标记载体的构...

【专利技术属性】
技术研发人员：王涛，王思雅，卢曾军，白兴文，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：