【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测，具体而言，涉及基于空间邻近化学发光的人磷酸化tau-181蛋白检测方法、试剂盒及应用。
技术介绍
1、阿尔茨海默病(alzheimer′s disease，ad)是一种脑退行性疾病，患者的智力、记忆、感觉、定向、推理和判定产生不可逆性的退化，严重危害人类健康。
2、我国针对ad临床前期开展了长达20年的纵向追踪调查研究，发现在症状出现前脑脊液生物标志物，包括aβ42、aβ42/40、磷酸化tau蛋白(phosphorylated tau，p-tau)181和神经丝轻链(neurofilament light chain，nfl)，呈现出随时间变化的特定模式。关注ad源性mci的病因及病理机制、尽早发现并管理ad源性mci，将有助于维持患者现有认知功能，延缓疾病进展。
3、在ad的诊断中，病理诊断经常被临床医学作为疾病诊断的金标准，但ad为大脑的病变，在病人生前进行脑组织检测属于有创性检查，难以让患者及家属接受，可行性较低。神经影像学被认为能够检测与ad有关的异常，但ad早期患者大脑无特异性形状学转变，因此特异性生物标志物的检测是ad早检的关键，目前国际公认的ad早期检测生物学标志物有人β淀粉样蛋白1-42(aβ1-42)、人磷酸化tau-181蛋白(p-tau-181)等。
4、在ad临床前期阶段，脑脊液中的aβ1-42和p-tau-181浓度水平既产生变化，大脑中过度生成的aβ1-42具有很强的集合力和神经毒性，其毒性作用会导致血-脑脊液屏障通透性增加，aβ1-42和
5、tau蛋白是一种主要在中枢神经系统的神经元表达的微管稳定蛋白，在星形胶质细胞和少突胶质细胞中也有少量表达，其过度磷酸化发生聚集导致的神经原纤维缠结是ad的标志性病理改变。tau蛋白片段上许多位点存在异常过度磷酸化，苏氨酸181(p-tau-181)即是众多磷酸化位点之一。脑脊液p-tau-181已被公认为是ad特异性的生物标志物之一。在《中国阿尔兹海默病痴呆诊疗指南》中推荐血浆p-tau-181鉴别ad痴呆与非ad痴呆的准确性较高。为满足阿尔兹海默病早筛防治的临床和社会需求，开发一种检测p-tau-181蛋白的试剂盒非常必要。目前检测p-tau-181蛋白的常见方法有酶联免疫法和化学发光法。
6、酶联免疫检测方法操作步骤复杂、耗时长，需要专业人员，且操作过程的影响因素较多，容易造成假阳性和假阴性结果等不足。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是提供基于空间邻近化学发光的人磷酸化tau-181蛋白检测方法、试剂盒及应用。
2、本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：
3、本专利技术提供一种试剂盒，所述试剂盒中包括酶标记物、发光标记物、发光辅助剂和触发剂，所述酶标记物为辣根过氧化物酶标记的第一抗p-tau-181单克隆抗体，所述发光标记物为9，10-二氢吖啶标记的第二抗p-tau-181单克隆抗体。
4、在上述技术方案的基础上，本专利技术还可以做如下改进。
5、进一步，所述发光辅助剂的成分中包括过氧化氢，所述触发剂的成分中包括吐温20。
6、本专利技术还提供如上述的试剂盒在检测人磷酸化tau-181蛋白中的应用。
7、本专利技术还提供一种基于空间邻近化学发光的人磷酸化tau-181蛋白检测方法，采用如上述的试剂盒对待测样本进行检测。
8、进一步，将待测样本、酶标记物、发光标记物混合并反应，得到反应物，再加入发光辅助剂和触发剂，检测反应物的发光值，得到所述待测样本中人磷酸化tau-181蛋白的含量。
9、进一步，所述反应物的发光值与所述待测样本中人磷酸化tau-181蛋白的含量正相关。
10、进一步，包括以下步骤：
11、s1、获取所述酶标记物和所述发光标记物；
12、s2、获取所述发光辅助剂和所述触发剂；
13、s3、获取人磷酸化tau-181蛋白校准品的发光值与浓度对应的标准曲线；
14、s4、采用所述酶标记物、所述发光标记物、所述发光辅助剂和所述触发剂检测待测样品，将得到待测样品发光值与所述标准曲线对比，得到所述待测样品中人磷酸化tau-181蛋白的含量。
15、进一步，步骤s1中，所述酶标记物的获取方法为：将辣根过氧化物酶的水溶液再与高碘酸钠、醋酸钠缓冲液混合并透析；加入碳酸盐缓冲液后，立即加入第一抗p-tau-181单克隆抗体，室温避光搅拌；加入硼氢化钠溶液并混匀，在4℃下放置2h；采用pbs在4℃下透析后，得到所述酶标记物；
16、所述发光标记物的获取方法为：向9，10-二氢吖啶的dmf溶液中加入硼酸钠缓冲液，再加入第二抗p-tau-181单克隆抗体并稀释，混匀后室温静置；在2-8℃下振荡混合过夜，得到所述发光标记物。
17、进一步，所述辣根过氧化物酶与所述第一抗p-tau-181单克隆抗体的质量比为1:0.8～1.2，所述9，10-二氢吖啶与所述第二抗p-tau-181单克隆抗体的质量比为4:0.8～2。
18、进一步，步骤s3中，所述标准曲线的获取方式为：采用所述酶标记物、所述发光标记物、所述发光辅助剂和所述触发剂分别检测多个浓度梯度的人磷酸化tau-181蛋白校准品，根据各所述人磷酸化tau-181蛋白校准品的发光值和浓度绘制所述标准曲线。
19、本专利技术的有益效果是：
20、(1)本专利技术的基于空间邻近化学发光的人磷酸化tau-181蛋白检测方法，将待测样本、辣根过氧化物酶标记的抗p-tau-181单克隆抗体、9，10-二氢吖啶标记的抗p-tau-181单克隆抗体一起反应，形成抗原、抗体夹心复合物，使得辣根过氧化物酶与9，10-二氢吖啶在空间上得以相互接近，加入发光辅助剂及触发剂后产生闪光型化学发光，从而实现检测；
21、(2)本专利技术的基于空间邻近化学发光的人磷酸化tau-181蛋白检测方法，灵敏度高，特异性好，稳定性好，对环境和人体无毒无害；
22、(3)本专利技术的基于空间邻近化学发光的人磷酸化tau-181蛋白检测方法，检测过程无需载体和洗涤步骤，不仅降低了检测方法的成本，也提高了检测效率，同时还具有良好的准确性；
23、(4)本专利技术的基于空间邻近化学发光的人磷酸化tau-181蛋白检测方法，是真正意义上的均相反应，检测结果更加真实可信；
24、(5)用于检测人磷酸化tau-181蛋白的试剂盒，组分少、生产过程简单、生产成本低，易于放大生产及全自动检测。
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1.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括酶标记物、发光标记物、发光辅助剂和触发剂，所述酶标记物为辣根过氧化物酶标记的第一抗p-tau-181单克隆抗体，所述发光标记物为9，10-二氢吖啶标记的第二抗p-tau-181单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述发光辅助剂的成分中包括过氧化氢，所述触发剂的成分中包括吐温20。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒在检测人磷酸化Tau-181蛋白中的应用。
4.一种基于空间邻近化学发光的人磷酸化Tau-181蛋白检测方法，其特征在于，采用如权利要求1或2所述的试剂盒对待测样本进行检测。
5.根据权利要求4所述的一种基于空间邻近化学发光的人磷酸化Tau-181蛋白检测方法，其特征在于，将所述待测样本、酶标记物、发光标记物混合并反应，得到反应物，再加入发光辅助剂和触发剂，检测反应物的发光值，得到所述待测样本中人磷酸化Tau-181蛋白的含量。
6.根据权利要求5所述的一种基于空间邻近化学发光的人磷酸化Tau-181蛋白检测方法，其特征在于，所述反应物的发光值与所
7.根据权利要求5所述的一种基于空间邻近化学发光的人磷酸化Tau-181蛋白检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的一种基于空间邻近化学发光的人磷酸化Tau-181蛋白检测方法，其特征在于，步骤S1中，所述酶标记物的获取方法为：将辣根过氧化物酶的水溶液再与高碘酸钠、醋酸钠缓冲液混合并透析；加入碳酸盐缓冲液后，立即加入第一抗p-tau-181单克隆抗体，室温避光搅拌；加入硼氢化钠溶液并混匀，在4℃下放置2h；采用PBS在4℃下透析后，得到所述酶标记物；
9.根据权利要求8所述的一种基于空间邻近化学发光的人磷酸化Tau-181蛋白检测方法，其特征在于，所述辣根过氧化物酶与所述第一抗p-tau-181单克隆抗体的质量比为1:0.8～1.2，所述9，10-二氢吖啶与所述第二抗p-tau-181单克隆抗体的质量比为4:0.8～2。
10.根据权利要求7所述的一种基于空间邻近化学发光的人磷酸化Tau-181蛋白检测方法，其特征在于，步骤S3中，所述标准曲线的获取方式为：采用所述酶标记物、所述发光标记物、所述发光辅助剂和所述触发剂分别检测多个浓度梯度的人磷酸化Tau-181蛋白校准品，根据各所述人磷酸化Tau-181蛋白校准品的发光值和浓度绘制所述标准曲线。
...【技术特征摘要】
1.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括酶标记物、发光标记物、发光辅助剂和触发剂，所述酶标记物为辣根过氧化物酶标记的第一抗p-tau-181单克隆抗体，所述发光标记物为9，10-二氢吖啶标记的第二抗p-tau-181单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述发光辅助剂的成分中包括过氧化氢，所述触发剂的成分中包括吐温20。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒在检测人磷酸化tau-181蛋白中的应用。
4.一种基于空间邻近化学发光的人磷酸化tau-181蛋白检测方法，其特征在于，采用如权利要求1或2所述的试剂盒对待测样本进行检测。
5.根据权利要求4所述的一种基于空间邻近化学发光的人磷酸化tau-181蛋白检测方法，其特征在于，将所述待测样本、酶标记物、发光标记物混合并反应，得到反应物，再加入发光辅助剂和触发剂，检测反应物的发光值，得到所述待测样本中人磷酸化tau-181蛋白的含量。
6.根据权利要求5所述的一种基于空间邻近化学发光的人磷酸化tau-181蛋白检测方法，其特征在于，所述反应物的发光值与所述待测样本中人磷酸化tau-181蛋白的含量正相关。
7.根据权利要求5所述的一种基...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨洪，王校，刘文波，朱柏延，孙玥明，胡守旺，史文钊，
申请(专利权)人：神州医疗生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：
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