一种乌司他丁的O-糖链的分析方法技术

本发明专利技术提供了一种糖蛋白的O糖链分析的方法。具体的，提供了一种乌司他丁O‑糖链的的分析方法，包括以下步骤：(1)将样品用链酶蛋白酶E酶切得到酶切后样品；(2)使荧光分子与酶切后样品进行反应，得到荧光标记的样品；(3)将所述荧光标记的样品进行超高压液相色谱串联四级杆飞行时间质谱联用(UPLC‑Q‑TOF‑MS/MS)分析，通过所得的质谱数据确定O糖链的结构。本发明专利技术的方法可以简便快速准确的确认出乌司他丁O糖链的具体糖型以及相对比例，可用于乌司他丁O糖链的日常检测，为乌司他丁的结构研究和质量控制提供重要依据。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及蛋白质分析，特别涉及乌司他丁的o-糖链的分析方法。

技术介绍

1、糖基化是一种常见的蛋白质修饰转译，对蛋白质的结构和功能有重要的影响，包括蛋白质的折叠、稳定性、分子识别和免疫原性等。超过一半的天然蛋白质在适当的丝氨酸/苏氨酸残基的羟基组织或者位于天冬酰胺―丝氨酸/苏氨酸共同体的天冬酰胺的酰胺基组织上被糖基化。

2、目前研究最多的糖基化主要有两种：n-糖基化和o-糖基化。n-糖基化发生在天冬酰胺的侧链，对于蛋白n-糖基化的分析方法已经比较成熟，相比而言，蛋白o-糖基化的鉴定分析目前仍存在着很大的技术瓶颈。o-糖基化发生在丝氨酸或苏氨酸的侧链，不存在蛋白质特征修饰序列，缺少高效特异的o-糖链释放酶。因此目前大多数研究人员都利用化学方法将o-连接糖链从肽段上释放下来，常用的化学法是碱性条件下的β-消除反应和肼解法。肼解法可以用于释放n-连接糖链和o-连接糖链，但是因为该方法的反应条件比较剧烈，反应条件严苛，容易引起爆炸且肼是一种剧毒物质。因此，肼解法没有得到广泛应用。而β-消除反应是指糖蛋白在碱性环境下不稳定易发生β-消除造成糖肽键断裂本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种乌司他丁O-糖链的分析方法，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，步骤(1)中所述的酶切具有一个或多个选自下组的技术特征：所述链酶蛋白酶E和乌司他丁的质量比为1：0.5-2，较佳的1：0.6-1.5，如1:0.8、1:1或1:1.2；

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤(1-a)，将步骤(1)所得的酶切后的样品进行色谱纯化，使用聚甲基丙烯酸树脂阴离子交换柱(如Super Q-650M)，洗脱，然后超滤除盐得到纯化样品。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(1-a)包括色谱纯化步骤：

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【技术特征摘要】

1.一种乌司他丁o-糖链的分析方法，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，步骤(1)中所述的酶切具有一个或多个选自下组的技术特征：所述链酶蛋白酶e和乌司他丁的质量比为1：0.5-2，较佳的1：0.6-1.5，如1:0.8、1:1或1:1.2；

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤(1-a)，将步骤(1)所得的酶切后的样品进行色谱纯化，使用聚甲基丙烯酸树脂阴离子交换柱(如super q-650m)，洗脱，然后超滤除盐得到纯化样品。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(1-a)包括色谱纯化步骤：

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光分子为罗丹明b异硫氰酸酯，异硫氰酸荧光素(如5-异硫氰酸荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明、7-异硫氰酸荧光素)。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述反应具有一个或多个选自下组的技术特征：

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤(2-b)，将步骤(2)所得的荧光标记的样品进行色谱纯化，使用凝胶过滤柱(如superdex 200increa...

【专利技术属性】
技术研发人员：张亚军，侯晓彦，范丽，贾小刚，孙铁，
申请(专利权)人：江苏艾迪药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：