【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其涉及一种基因突变检测方法及其应用。
技术介绍
1、癌症的术前诊断和复发预测有助于及时确定手术方案和降低治疗成本。液体活检或穿刺活检因其具有微创性便于在整个疾病过程中轻松获得样本成为肿瘤采样的主流方式。活检样本中含有的肿瘤特异性的突变蕴含着重要的疾病线索，是肿瘤诊断和伴随治疗的有效指标。如braf v600e突变可作为甲状腺癌穿刺结节良恶性的指标，对其进行精准检测可辅助进行甲状腺结节的良恶性判断。但因活检样本中基因组dna含量低、突变丰度低的特点对突变检测工具提出了超灵敏和高特异的性能要求。
2、核酸探针因严格的碱基互补配对原则对靶标的识别具有较好的特异性。其中，杂交热力学极为有利的核酸探针(如链交换探针)在检测突变具有高的灵敏度。但该类核酸探针因过于稳定，对单碱基的突变极其不敏感。为了增强核酸探针识别突变的敏感度，减弱其与突变靶标之间的结合是最常用的手段。该设计理念主要依赖探针与野生型dna的反应的δg趋于零附近时，核酸探针识别突变的特异性最佳。例如，在arms-pcr中，通过在引物中引入错配或发卡结构减弱与靶标的互补能力。或在单链探针中引入发卡使得探针与突变的杂交不如单链探针的杂交有利，从而允许更高的特异性。其他杂交探针如代表性的toeholdexchange探针，通过在链交换探针中引入反向的黏性末端，也旨在降低杂交的热力学优势，从而提高探针的特异性。通过对上述探针进行改进或实验优化可以进一步提高突变检测的特异性。但同时也会极大地牺牲检测突变的灵敏度。因此，在经典的核酸杂交探针设计中，往往在
3、理想的杂交探针总是需要牺牲灵敏度以达到最佳的特异性，因此，需要发展一种新的低丰度基因突变检测方法，能够同时在宽浓度范围内实现高的灵敏度和高特异性，从根本上传统杂交探针灵敏度和特异性相互制衡的问题。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本申请提供了一种基因突变检测方法，该方法使用三条新核酸探针，可实现高灵敏度、高特异性且经济的优点，能够在宽的浓度范围内很好地实现低丰度的临床样品中突变的检测，具有更好的推广意义。
2、本专利技术的第一方面，提供了一种基因突变检测方法，所述的检测方法包括使用三条核酸探针，其中第一探针的末端各包含一个荧光基团修饰，第二探针的末端各包含一个荧光猝灭基团修饰，第三探针的5’端或3’端包含一个荧光猝灭基团修饰。
3、优选的，所述的第一探针和第二探针组合为双链探针组，第三探针与第一或第二探针包含相同的核苷酸序列。
4、优选的，所述的第一探针和第二探针至少有15bp互补，所述的第一探针和第二探针可以完全或部分互补。
5、优选的，所述的荧光基团包括但不限于alex-350、fam、vic、tet、cal gold540、joe、hex、cal orange560、tamra、cal red590、rox、cal red610、texas red、cal red635、quasar670、cy3、cy5、cy5.5和/或quasar705。
6、优选的，所述的荧光猝灭基团包括但不限于dabcyl、bhq类淬灭剂、eclipse和/或tamra。
7、优选的，所述bhq类淬灭剂包括bhq-1和/或bhq-2。
8、优选的，所述的第一探针末端两个荧光基团相同或不同，进一步优选的，所述的第一探针两个末端包括不同的荧光基团。
9、优选的，所述的第二探针末端两个荧光猝灭基团相同或不同，进一步优选的，所述的第二探针两个末端包括不同的荧光猝灭基团。
10、优选的，所述的第三探针的荧光猝灭基团与第二探针的荧光猝灭基团不同或与其中一个末端的荧光猝灭基团相同，进一步优选的，所述的第三探针的荧光猝灭基团与第二探针其中一个末端的荧光猝灭基团相同。
11、优选的，所述探针的序列包含野生型或突变靶序列的互补序列。
12、优选的，所述探针的序列与野生型或突变靶序列的互补序列相比具有一个或多个错配。
13、优选的，所述错配是单碱基的转换、颠换、插入或缺失。
14、优选的，所述突变包括单核苷酸突变。
15、优选的，所述单核苷酸突变是同一物种的不同个体间的同一基因座位上的核酸序列中的一个或多个相同或不同位置的单碱基的转换、颠换、插入或缺失，且所述基因组的一个或多个核酸区段相同或不同。
16、优选的，所述探针由未经修饰的碱基组成。
17、优选的，所述的探针的碱基序列可以包含特殊修饰。这些特殊修饰的碱基可以帮助调节探针的结合能力，例如增强探针结合能力或者削弱结合能力。比如能够增强探针结合能力的特殊修饰碱基如锁定核酸(即locked nucleic acids，缩写为lna)碱基或肽核酸(pna)等。因此，在一个实施方案中，本专利技术的探针可由未经修饰的碱基组成。在一个优选实施方案中，对探针的碱基进行修饰。在一个优选实施方案中，本专利技术的探针包含能增强或减弱探针结合能力的碱基。
18、优选的，所述的检测方法包括：
19、(1)将第一探针和第二探针混合，加入待测靶序列，检测荧光强度；
20、(2)加入第三探针，检测荧光强度。
21、优选的，所述的检测方法包括将第一探针和第二探针及待测靶序列混合后获得中间体，进一步加入第三探针后获得催化产物，所述的中间体为第一探针与待测靶序列的组合物，所述的催化产物为第一探针与第三探针的组合物，分别检测中间体和催化产物的荧光强度。
22、优选的，所述的检测方法通过检测荧光强度判断是否存在突变，突变靶序列与不存在野生型靶序列的情况相比，中间体和催化产物荧光或荧光强度增加，当存在野生型靶核酸序列的情况时，无荧光或荧光强度弱，不产生荧光响应。
23、优选的，所述的检测方法还包括与其他方法的联用，所述的其他方法包括但不限于pcr法、lcr法、tas法、ican法、lamp法、nasba法、rca法、tama法和/或ucan法。
24、在一个具体实施方式中，所述的检测方法还包括进行pcr使用的相关试剂，所述的试剂包括pcr引物及组装探针。
25、优选的，所述的pcr引物包括seq id no：74-75。
26、优选的，所述的组装探针包括包括seq id no：74-78。
27、优选的，所述的探针的序列包括seq id no：3-4、14-15、18-19、22-23、26-27、30-31、34-35、38-39、42-43、46-47、50-51、54-55、58-59、62-63、66-67、70-71任一所示的核苷酸序列或与seq id no：3-4、14-15、18-19、22-23、26-27、30-31、34-35、38-39、42-43、46-47、50-51、54-55、58-59、62-63、66-67、70-71任一所示的核苷本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基因突变检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括使用三条探针，其中第一探针的末端各包含一个荧光基团修饰，第二探针的末端各包含一个荧光猝灭基团修饰，第三探针的5’端或3’端包含一个荧光猝灭基团修饰。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的第一探针和第二探针组合为双链探针组，所述的第一探针和第二探针至少有15bp互补，第三探针与第一或第二探针包含相同的核苷酸序列。
3.根据权利要求1-2任一所述的检测方法，其特征在于，所述的荧光基团包括ALEX-350、FAM、VIC、TET、CAL Gold540、JOE、HEX、CAL Orange560、TAMRA、CAL Red590、ROX、CALRed610、TEXAS RED、CAL Red635、Quasar670、CY3、CY5、CY5.5和/或Quasar705；
4.根据权利要求1-3任一所述的检测方法，其特征在于，所述的第一探针末端两个荧光基团相同或不同，所述的第二探针末端两个荧光猝灭基团相同或不同，所述的第三探针的荧光猝灭基团与第二探针的荧光猝灭基团不同或至少与其中一
5.根据权利要求1-4任一所述的检测方法，其特征在于，所述探针的序列包含野生型或突变靶序列的互补序列，或者，所述探针的序列与野生型或突变靶核酸序列的互补序列相比具有一个或多个错配。
6.根据权利要求1-5任一所述的检测方法，其特征在于，所述突变包括单核苷酸突变。
7.根据权利要求1-6任一所述的检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括：
8.根据权利要求1-7任一所述的检测方法，其特征在于，所述的检测方法还包括与其他方法的联用，所述的其他方法包括PCR法、LCR法、TAS法、ICAN法、LAMP法、NASBA法、RCA法、TAMA法和/或UCAN法。
9.一种应用权利要求1-8任一所述的基因突变检测方法的探针的探针组，其特征在于，所述的探针组包括所述的第一、第二和第三探针。
10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求9所述的探针组。
...【技术特征摘要】
1.一种基因突变检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括使用三条探针，其中第一探针的末端各包含一个荧光基团修饰，第二探针的末端各包含一个荧光猝灭基团修饰，第三探针的5’端或3’端包含一个荧光猝灭基团修饰。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的第一探针和第二探针组合为双链探针组，所述的第一探针和第二探针至少有15bp互补，第三探针与第一或第二探针包含相同的核苷酸序列。
3.根据权利要求1-2任一所述的检测方法，其特征在于，所述的荧光基团包括alex-350、fam、vic、tet、cal gold540、joe、hex、cal orange560、tamra、cal red590、rox、calred610、texas red、cal red635、quasar670、cy3、cy5、cy5.5和/或quasar705；
4.根据权利要求1-3任一所述的检测方法，其特征在于，所述的第一探针末端两个荧光基团相同或不同，所述的第二探针末端两个荧光猝灭基团相同或不同，...
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