一种GlcNAc6P感应元器件及促进乙酰氨基葡萄糖合成的方法技术

本发明专利技术公开了一种GlcNAc6P感应元器件及促进乙酰氨基葡萄糖合成的方法。现有GlcNAc6P感应元器件存在泄露严重、响应范围小的问题，这导致利用GlcNAc6P感应元器件调控磷酸酶表达的过程中，在胞内GlcNAc6P未积累时磷酸酶也具有较高的表达强度，影响了前体物质的供给。此外，随着胞内GlcNAc6P浓度的快速提高，磷酸酶的表达量上限较低，无法满足胞内去磷酸化的需求，限制了GlcNAc产量的进一步提高。因此本发明专利技术对现有的GlcNAc6P感应元器件进行优化，对nagC结合序列进行定向进化以及优化阻遏蛋白nagC表达强度，降低传感器泄露表达水平的同时扩大其响应范围，从而更有效更严谨的调控磷酸酶的表达强度以适应发酵不同时期细胞内GlcNAc6P浓度的变化，为进一步代谢工程改造重组菌生产乙酰氨基葡萄糖奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种glcnac6p感应元器件及促进乙酰氨基葡萄糖合成的方法，属于基因工程。

技术介绍

1、乙酰氨基葡萄糖是生物体内的一种单糖，广泛存在于细菌、酵母、霉菌、植物以及动物体内。在人体中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软骨及关节组织功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被广泛作为药物和营养膳食添加来治疗和修复关节损伤。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妆品和制药领域也具有诸多应用。

2、现如今微生物发酵法是国内外生产乙酰氨基葡萄糖的主要方法。所使用的基因工程菌主要为大肠杆菌(escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)和枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis，b.subtilis)。通过在这些菌株中引入氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glms)和氨基葡萄糖6-磷酸n-乙酰转移酶(gna1)编码基因，以葡萄糖为原料，进行乙酰氨基葡萄糖的微生物合成。其中合成反应的最后一步为n-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸(glcnac6p)的去磷酸化反应，由磷酸酶将glcnac6p转化为乙酰氨基葡萄糖。对乙酰氨基葡萄糖的生物合成研究表明在大肠杆菌中，由于细胞自身的磷酸酶反应速度低于glcnac6p的合成速度，glcnac6p积累对细胞有毒性，会引起细胞生长抑制现象，造成了生产速率降低，不利于生产经济性。通过过表达yqab和bt4131等磷酸酶可以有效缓解glcnac6p的积累，提高乙酰氨基葡萄糖的产量。

3、磷酸酶的活性中心与磷酸基团具有较强的结合力，导致了磷酸酶普遍具有宽泛的底物谱，对乙酰氨基葡萄糖合成途径中的磷酸糖前体glc6p(葡萄糖-6-磷酸)，fru6p(果糖-6-磷酸)和glcn6p(氨基葡萄糖-6-磷酸)均具有去磷酸化活性，因此组成型表达磷酸酶导致胞内磷酸糖前体浓度降低，以及产生其它副产物，从而导致转化率的降低和影响生产经济性。利用转录因子nagc的glcnac6p响应特性构建glcnac6p感应元器件，并通过此感应元器件调控磷酸酶表达，以应对生产过程各阶段glcnac6p的不同程度的积累，从而在利用磷酸酶强化glcnac6p去磷酸化反应的同时，减少了对前体物质glc6p、fru6p、glcn6p的影响，有效提高了大肠杆菌的乙酰氨基葡萄糖的产量和原料的转化率。但目前发表的glcnac6p感应元器件响应范围较小，泄露表达严重，表达强度上限较低，在glcnac6p大量积累时难以大幅提高磷酸酶表达量以缓解磷酸糖压力。此外，较高的泄露表达强度会导致在glcnac6p未积累时磷酸酶过量表达，从而影响了胞内磷酸化底物的正常代谢进而影响了产物的合成。现有的glcnac6p感应元器件均基于自然存在的野生型nagc结合序列所设计，未对结合序列进行人工改造或定向进化，响应范围存在进一步优化的潜力。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本专利技术首先针对现有glcnac6p感应元器件响应范围有限、泄露表达高等缺陷进行了感应元器件的优化，构建了

2、pacyc-duet1-pnagbm-bt4131/i49q/l129q/g172l-pj23118-nagc质粒，大幅度降低了磷酸酶的泄露表达，并扩大了响应范围。本专利技术将其感应元器件应用在乙酰氨基葡萄糖的生产中，发现进一步提高了产物合成产量及生产强度。

3、本专利技术的第一个目的是提供一种n-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸感应元器件，包括：

4、由第一启动子调控表达的磷酸酶；

5、由第二启动子调控表达的转录因子nagc；

6、所述第一启动子的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述第二启动子为pj23118启动子。

7、进一步地，所述磷酸酶为乙酰氨基葡萄糖-6磷酸磷酸酶，可为野生型或突变体，包括但不限于seq id no.5所示的氨基酸序列或其突变体。

8、进一步地，所述突变体包括但不限于：

9、将第129位亮氨酸突变为谷氨酰胺(l129q)；或

10、将第49位异亮氨酸突变为谷氨酰胺，并将第129位亮氨酸突变为谷氨酰胺(i49q/l129q)；或

11、将第49位异亮氨酸突变为谷氨酰胺，将第129位亮氨酸突变为谷氨酰胺，并将第172位甘氨酸突变为亮氨酸(i49q/l129q/g172l，seq id no.6)。

12、进一步地，所述pj23118启动子的序列如seq id no.3所示。

13、进一步地，所述转录因子nagc的氨基酸序列如seq id no.4所示。

14、本专利技术的第二个目的是提供一种用于磷酸酶调控表达的启动子，所述启动子的序列如seq id no.2所示。

15、本专利技术的第三个目的是提供一种动态调控表达系统，所述动态调控表达系统中包括所述n-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸感应元器件或所述启动子。

16、进一步地，所述动态调控表达系统中还包括n-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸。

17、本专利技术的第四个目的是提供编码所述n-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸感应元器件、启动子或动态调控表达系统的核酸分子。

18、本专利技术的第五个目的是提供携带所述核酸分子的基因表达框或重组质粒。

19、进一步地，所述重组质粒的载体骨架包括pacyc-duet1。

20、本专利技术的第六个目的是提供含有所述基因表达框或重组质粒的重组细胞。

21、进一步地，所述重组细胞的宿主细胞包括微生物，如细菌或真菌。

22、本专利技术的第七个目的是提供所述n-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸感应元器件、启动子、动态调控表达系统、核酸分子、基因表达框或重组质粒、重组细胞在动态调控n-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸(glcnac6p)的去磷酸化反应或在乙酰氨基葡萄糖合成中的应用。

23、本专利技术的第八个目的是提供一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌中含有所述n-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸感应元器件。

24、进一步地，所述重组大肠杆菌还包括但不限于以下改造：敲除了甘露糖特异性eiiab组分相关基因manxyz、n-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶基因naga、氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶基因nagb、n-乙酰氨基葡萄糖特异性eiicba组分基因nage、l-岩藻糖异构酶基因fuci、l-岩藻糖激酶基因fuck、乳酸脱氢酶基因ldha和丙酮酸氧化酶基因poxb，强化表达了氨基葡萄糖6-磷酸n-乙酰转移酶基因gna1和氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶基因glms。

25、进一步地，所述强化表达为过表达(本专利技术实施例中为整合表达)具有至少两个t7lac启动子控制的gna1基因与具有至少一个t7lac启动子控制的glms基因。

26、进一步地，甘露糖特异性eiiab组分相关基因manx的ncbi编号为946334、many的ncbi编号为946332、manz的ncbi编号为946342，n-乙酰葡糖胺-6-磷本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸感应元器件，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸感应元器件，其特征在于，至少包含以下特征中的一项：

3.一种启动子，其特征在于，所述启动子的序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种动态调控表达系统，其特征在于，所述动态调控表达系统中包括权利要求1或2所述N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸感应元器件或权利要求3所述启动子。

5.编码权利要求1或2所述N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸感应元器件、权利要求3所述启动子或权利要求4所述动态调控表达系统的核酸分子。

6.携带权利要求5所述核酸分子的基因表达框或重组质粒。

7.含有权利要求6所述基因表达框或重组质粒的重组细胞。

8.权利要求1或2所述N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸感应元器件、权利要求3所述启动子、权利要求4所述动态调控表达系统、权利要求5所述核酸分子、权利要求6所述基因表达框或重组质粒、权利要求7所述重组细胞在动态调控N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸的去磷酸化反应或在乙酰氨基葡萄糖合成中的应用。</p>

9.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌中含有权利要求1或2所述N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸感应元器件。

10.根据权利要求9所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌还包括以下改造：敲除了甘露糖特异性EIIAB组分相关基因manXYZ、N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶基因nagA、氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶基因nagB、N-乙酰氨基葡萄糖特异性EIICBA组分基因nagE、L-岩藻糖异构酶基因fucI、L-岩藻糖激酶基因fucK、乳酸脱氢酶基因ldhA和丙酮酸氧化酶基因poxB，强化表达了氨基葡萄糖6-磷酸N-乙酰转移酶基因GNA1和氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶基因glmS。

...

【技术特征摘要】

1.一种n-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸感应元器件，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的n-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸感应元器件，其特征在于，至少包含以下特征中的一项：

3.一种启动子，其特征在于，所述启动子的序列如seq id no.2所示。

4.一种动态调控表达系统，其特征在于，所述动态调控表达系统中包括权利要求1或2所述n-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸感应元器件或权利要求3所述启动子。

5.编码权利要求1或2所述n-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸感应元器件、权利要求3所述启动子或权利要求4所述动态调控表达系统的核酸分子。

6.携带权利要求5所述核酸分子的基因表达框或重组质粒。

7.含有权利要求6所述基因表达框或重组质粒的重组细胞。

8.权利要求1或2所述n-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸感应元器件、权利要求3所述启动子、权利要求4所...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙，卢健行，陈坚，吕雪芹，刘长峰，堵国成，卢建功，李贵伶，
申请(专利权)人：山东润德生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：