【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药，具体涉及一种预防或治疗恶性肿瘤的mrna疫苗及其制备方法与应用。
技术介绍
1、2019冠状病毒病(covid-19)的全球大流行使得基于mrna(信使核糖核酸)技术疫苗的发展和应用获得世界瞩目。这项技术的成熟和进展也赋予了mrna疫苗在其他领域，尤其是在癌症治疗领域的巨大潜力。医界和科学界都希望mrna疫苗可以成为下一个对抗癌症，挽救病人生命的治疗手段。肿瘤疫苗通过利用肿瘤相关抗原诱导机体的特异性细胞免疫和体液免疫反应，通过增强自身对肿瘤的抵抗力抑制肿瘤生长，从而达到控制肿瘤的目的。目前肿瘤疫苗可分为4大类：基于肿瘤细胞或者抗原提呈细胞的全细胞疫苗、肿瘤多肽疫苗、基于病毒载体的疫苗和基于核酸的疫苗。其中核酸疫苗又包括了dna疫苗和rna疫苗。与其他种类的癌症疫苗相比较，基于mrna的疫苗具有显著的优势，包括研发生产迅速，更安全，且能诱发产生更高效的免疫反应。主要表现在mrna疫苗仅瞬时表达肿瘤抗原且不与基因组dna相互作用，因此减少传统，如病毒载体疫苗和dna疫苗带来的基因组整合风险。更重要的是，mrna疫苗可以进行更灵活的组合，编码一种或多种抗原，包括抗原蛋白的全长或者部分多肽段，更易实现多价疫苗的功效，方便灵活选择同时使用多种抗原增强疫苗的效果。与传统灭活疫苗或重组蛋白疫苗相比，mrna疫苗可以更高效地激活细胞反应达到更好的预防疗效。以上优点使得mrna肿瘤疫苗具有强大的临床应用前景，成为目前的研究热点。
2、目前大多数mrna肿瘤疫苗仍处于临床试验阶段，尚未明确疗效。如何设计能诱导特异
3、然而，现有抗肿瘤mrna疫苗存在以下缺点：1)目前获批的或者正处于临床试验阶段的mrna疫苗所应用的主流lnp系统(dlin-mc3-dma(mc3),alc-0315和sm-102)具有稳定性差，保存条件苛刻等问题。2)以肿瘤特异性抗原为靶点的mrna疫苗只适合个性化肿瘤疫苗研制，存在成本高，难以规模化生产的缺点。3)以肿瘤相关抗原为靶点的mrna疫苗生产成本较低，但由于正常组织和细胞也可能含有该相关抗原较低水平的表达，存在诱发自身免疫毒性的风险。4)编码全长抗原序列的mrna疫苗能更有效的引起t细胞反应，但是目前还没有相关抗肿瘤mrna疫苗获批上市，安全性还需进一步考证。5)nid1在多种癌症中高表达，并对肿瘤微环境有重要调控作用，前期研究表明是安全且有效的泛癌靶点，但目前仍未有以nid1为抗原靶点的抗肿瘤疫苗上市。
技术实现思路
1、针对目前抗肿瘤疫苗存在的问题和nid1作为疫苗抗原的前景，本专利技术以nid1为抗原，提供了一种用于恶性肿瘤预防和治疗的mrna疫苗，该疫苗编码nid1的全长蛋白，只需要低剂量即可有效抑制肿瘤生长或者预防肿瘤生成，安全性好，制备工艺简单。
2、为实现以上目的，本专利技术所采用的技术方案包括：
3、第一方面，本专利技术提供一种编码nid1抗原的核酸分子，所述核酸分子的核苷酸序列如(a)或(b)所示：
4、(a)核苷酸序列如seq id no：1或seq id no：2所示；
5、(b)在(a)中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸且具有编码nid1抗原功能的由(a)衍生的核苷酸序列。
6、所述核酸分子包含5’-帽结构、5’-utr、3’-聚核苷酸序列以及3’-utr中的至少一种。其中，5’-utr为10-200个核苷酸，优选的50-100个核苷酸；3’-utr为50-250个核苷酸，优选为100-200个核苷酸；3’-聚核苷酸序列为70-150个a，进一步优选为100-120个a。
7、本专利技术所述核酸分子能编码全长nid1抗原，具有良好的免疫原性，能在短时间内诱导机体产生强烈的细胞及体液免疫反应，从而达到预防或治疗恶性肿瘤的目的。
8、优选地，所述核酸分子包括dna、aso、sirna、mirna、mrna和适配体中的至少一种，更优选地，所述核酸分子为mrna。
9、第二方面，本专利技术提供了一种核酸-脂质体复合物，所述核酸-脂质体复合物包括所述的核酸分子，以及包裹核酸分子的阳离子脂质纳米颗粒。
10、优选地，所述阳离子脂质纳米颗粒与核酸分子的摩尔比为(2-10)：1。
11、优选地，所述阳离子脂质纳米颗粒包括以下摩尔百分比的组分：15-49％阳离子脂质、40-50％结构脂质、5-20％辅助脂质和1-5％聚乙二醇化脂质。
12、优选地，所述结构脂质包括胆固醇或其衍生物，所述辅助脂质包括dspc、dope、dopg和dops中的任一种，所述聚乙二醇化脂质包括peg-dmg或peg-dspe。
13、更优选地，所述结构脂质为胆固醇，所述辅助脂质为dspc，所述聚乙二醇化脂质为peg-dmg。
14、本专利技术所述包覆核酸分子的阳离子脂质纳米颗粒能确保将编码肿瘤相关抗原的mrna有效递送至靶细胞，防止其在体内被降解，并且实现瞬时表达肿瘤相关抗原，激活机体的免疫反应，且在一定程度上能促进免疫系统的启动和调节，增强肿瘤免疫治疗的效果。
15、第三方面，本专利技术提供了所述的核酸-脂质体复合物的制备方法，包括以下步骤：
16、s1、将阳离子脂质、结构脂质、辅助脂质和聚乙二醇化脂质溶于有机溶剂中，得到有机相；
17、s2、将核酸分子溶于溶媒缓冲液中，得到水相；
18、s3、将有机相和水相充分混本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种编码NID1抗原的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如(a)或(b)所示：
2.如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括DNA、ASO、siRNA、miRNA、mRNA和适配体中的至少一种。
3.一种核酸-脂质体复合物，其特征在于，所述核酸-脂质体复合物包括权利要求1或2所述的核酸分子，以及包裹核酸分子的阳离子脂质纳米颗粒。
4.如权利要求3所述的核酸-脂质体复合物，其特征在于，所述阳离子脂质纳米颗粒与核酸分子的摩尔比为(2-10)：1。
5.如权利要求3所述的核酸-脂质体复合物，其特征在于，所述阳离子脂质纳米颗粒包括以下摩尔百分比的组分：15-49％阳离子脂质、40-50％结构脂质、5-20％辅助脂质和1-5％聚乙二醇化脂质。
6.如权利要求5所述的核酸-脂质体复合物，其特征在于，所述结构脂质包括胆固醇或其衍生物，所述辅助脂质包括DSPC、DOPE、DOPG和DOPS中的任一种，所述聚乙二醇化脂质包括PEG-DMG或PEG-DSPE。
7.如权利要求5或6所述的核酸-脂质
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述有机相中阳离子脂质、结构脂质、辅助脂质和聚乙二醇化脂质的总浓度1-30mg/mL，所述水相中核酸分子的浓度为0.2-1.5mg/mL，所述有机相和水相的体积比为1：(2-6)。
9.如权利要求1或2所述的核酸分子，和/或权利要求3-6任一项所述的核酸-脂质体复合物在制备预防或治疗恶性肿瘤的药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物包括疫苗，所述恶性肿瘤包括肝癌和肺癌。
...【技术特征摘要】
1.一种编码nid1抗原的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如(a)或(b)所示：
2.如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括dna、aso、sirna、mirna、mrna和适配体中的至少一种。
3.一种核酸-脂质体复合物，其特征在于，所述核酸-脂质体复合物包括权利要求1或2所述的核酸分子，以及包裹核酸分子的阳离子脂质纳米颗粒。
4.如权利要求3所述的核酸-脂质体复合物，其特征在于，所述阳离子脂质纳米颗粒与核酸分子的摩尔比为(2-10)：1。
5.如权利要求3所述的核酸-脂质体复合物，其特征在于，所述阳离子脂质纳米颗粒包括以下摩尔百分比的组分：15-49％阳离子脂质、40-50％结构脂质、5-20％辅助脂质和1-5％聚乙二醇化脂质。
6.如权利要求5所述的核酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：肖芷洁，查高峰，毛晓雯，夏恒，
申请(专利权)人：中山大学附属第七医院深圳，
类型：发明
国别省市：
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