【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及血液制品领域，特别是涉及一种凝血酶原的纯化及激活的方法，所述方法既可以适用于人凝血酶的激活及后续的纯化制备，也适用于动物原凝血酶的激活及纯化制备，可以大幅提高单位血浆的凝血酶收率。
技术介绍
1、凝血酶原是由肝脏合成的维生素k依赖因子之一，含579个氨基酸残基的单链糖蛋白，分子量72kd。自n-末端起，有1个gla区(1-40)，2个环区(41-271)和1个催化区(271-579)。gla区内含10个r-羧基谷氨酸残基，主要功能为通过结合钙离子与磷脂联结。环区1参与其与底物和辅因子间的相互作用，环区2可与fⅴa结合，并含有fⅹa的作用位点组氨酸205～精氨酸220。催化区包括激活区和丝氨酸蛋白酶区。在钙离子、fⅴa和磷脂的参与下，凝血酶原被fⅹa激活。凝血酶原单独在精氨酸320处裂解生成一个中间产物，进一步分别在精氨酸284和精氨酸155处裂解生成凝血酶和凝血酶原片段1及凝血酶原片段2。凝血酶由a链和b链经二硫键联结组成，含295个氨基酸残基，分子量36kd。a链含36个氨基酸残基，又称轻链，其功能不明。b链含259个氨基酸残基，又称重链，是酶活性所在的部位，凝血酶原催化区中的丝氨酸蛋白酶即在b链。丝氨酸蛋白酶区具有蛋白酶活性，含识别并裂解底物的部位，酶活性氨基酸为组氨酸363，天门冬氨酸419和丝氨酸525，该区精氨酸382-精氨酸393片段称为阴离子结合部位，是凝血酶原与纤维蛋白原，血栓调节蛋白和水蛭素作用的部位。
2、凝血酶可使纤维蛋白原转变成纤维蛋白外还具有：诱导血小板聚集；激活ⅹⅲ因子；使纤
3、凝血酶早在20世纪四十代年即被纯化出来，系用饱和硫酸铵沉淀分离凝血酶原。20世纪六七十年代，主要添加草酸盐等采用等电点沉淀法、柠檬酸钡吸附法等获得凝血酶原，然后用钙离子或其他激活剂(柠檬酸盐)把凝血酶原激活成凝血酶。此类从血浆中提取纯化制备凝血酶的方法虽然简单、容易操作，但产量和比活都较低，且提取完凝血酶原后，血浆即被废弃，只适合动物来源的血浆。进入20世纪九十年代及21世纪初，出现了一些新的提取和纯化凝血酶的方法，包括离子交换层析以及亲和层析等，虽然能得到较高纯度和活力的凝血酶，但工艺复杂、用时长、生产成本较高。
4、us patent 5907032报道了一种以去冷沉淀血浆为原料生产凝血酶的方法，通过deae-cellose吸附法，取得含凝血因子复合物的洗脱液，然后向洗脱液中加入70mmol/l钙离子，ph控制在6.4～6.6，在20℃孵育18小时可以大量生成凝血酶。us patent 5714370也介绍了一种利用钙离子激活产生凝血酶的工艺，其采用2.5mmol/l的钙离子浓度，在ph7.0，30℃条件下激活80min后，1iu凝血酶原可产生48iu的凝血酶效价。另外中国专利cn02117151.3公开了一种纯化激活生产凝血酶的方法，从8kg组分iii中提取纯化得到7万iu的凝血酶，换算后每吨血浆可得80万iu凝血酶，因其初始组分中凝血酶原效价含量就较低，所以最终凝血酶效价回收量明显较低。中国专利cn201610614283.8也公开了一种从血浆组分中分离激活纯化凝血酶的方法，其每吨血浆的凝血酶回收有一定提高可达500-1000万iu。以上凝血酶制备方法主要缺点是凝血酶原回收率不高，回收后的凝血酶原激活效率不高，而凝血酶原激活过程是指数级放大的过程，以上两步直接决定了单位血浆凝血酶效价的收率。
5、鉴于以上所述现有技术缺点，本专利技术提供一种从混合血中提取激活凝血酶原的方法，此法既操作简单，又能极大的提高凝血酶收率，使单位凝血酶生产成本大幅降低。
6、为实现以上目的，本专利技术提供一种凝血酶原提取及激活的方法，包括如下步骤：
7、1)将去冷沉淀血浆用阴离子交换树脂进行吸附，经洗涤、洗脱，所得洗脱液即为纯化的凝血酶原溶液；
8、2)对步骤1)所得凝血酶原溶液用超滤膜进行超滤和浓缩，调整溶液中凝血酶原及凝血因子x浓度；
9、3)对步骤2)所得溶液，用盐酸调整ph，经除菌过滤后向其中加入激活剂，混匀后进行激活。
10、详细的说，步骤1)中所述阴离子交换树脂为deae sephadex-a50，每吨血浆加入deae sephadex-a50离子交换树脂的干重可以为0.5～2.0kg。所用的离子交换树脂洗涤液成分含枸橼酸钠和氯化钠，其中枸橼酸钠含量可以为0.15～0.25mol/l，氯化钠含量为可以为0.05～0.1mol/l，ph值6.5～7.5，洗脱液成分含枸橼酸钠和氯化钠，其中枸橼酸钠含量可以为0.15～0.25mol/l，氯化钠含量可以为0.5～1.5mol/l，ph值6.5～7.5。每吨血浆所得洗脱液范围为50～100l。
11、具体实施时步骤2)中所述超滤膜截留孔径大小为5kd或10kd或30kd，所用超滤缓冲液为注射用水，所用注射用水温度小于等于25℃，经超滤后最终溶液的电导率值为0.01～2.50ms/cm，在具体实施时，超滤后的凝血酶原溶液中凝血酶原效价控制在15～30iu/ml，此溶液可立即进行下一步操作也可以冻存在-20～-30℃冷库或者冰柜中暂存。
12、具体实施时步骤2)中所述超滤后凝血酶原溶液在添加激活剂进行激活时，具体实施时可以直接用冷注射用水调整，使其中的凝血酶原的最终浓度范围为5～15iu/ml,使其中的凝血因子x含量为凝血酶原含量的50％至150％，其最佳浓度含量为100％；
13、具体实施时步骤3)中所述调整ph所用盐酸浓度范围为0.1～0.5mol/l，调整后溶液的最终ph浓度范围为6.5～8.5，其最佳ph值为7.5；ph值调整完后，应进行除菌过滤，除菌过滤时凝血酶原溶液和激活剂溶液需分别进行除菌过滤。
14、具体实施时步骤3)中所述的凝血酶原激活剂为1mol/l氯化钙溶液，加入待激活的凝血酶原溶液时应进行除菌过滤，待激活凝血酶原溶液中最终钙离子浓度范围为20～60mmol/l，其最佳浓度为40mmol/l。
15、具体实施时步骤3)中所述凝血酶原激活的温度范围为0～10℃，孵育激活过程中可进行搅拌也可在静止条件下进行，孵育时间为6～15天。
16、如上所述，本专利技术中的凝血酶原纯化提取效率高，deae sephadex-a50吸附步骤凝血酶原收率最高可达理论回收率的90％以上；凝血酶原激活效率高，每iu凝血酶原可激活得到207.5iu的凝血酶效价，每吨血浆最高可激活本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.本专利技术涉及一种凝血酶原提取及激活的方法，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述凝血酶原提取方法，步骤1)中所述阴离子交换树脂为DEAESephadex-A50，每吨血浆所得洗脱液范围为50～100L。
3.根据权利要求1所述凝血酶原提取方法，步骤2)中所述超滤膜截留孔径大小为5KD或10KD或30KD，所用超滤缓冲液为注射用水，所用注射用水温度不高于25℃，经超滤后最终溶液的电导率值为0.01～2.50ms/cm。
4.根据权利要求1所述凝血酶原提取方法，步骤2)中所述超滤后凝血酶原溶液中凝血酶原的最终浓度范围为5～15IU/ml,其最佳浓度为10IU/ml。
5.根据权利要求1所述凝血酶原提取方法，步骤2)中所述超滤后凝血酶原溶液中除含有凝血酶原外，还含有凝血因子X，其含量为凝血酶原含量的50％至150％，其最佳浓度含量为100％。
6.根据权利要求1所述凝血酶原激活方法，步骤3)中所述调整pH所用盐酸浓度范围为0.1～0.5mol/L；调整后溶液的最终pH浓度范围为6.5～8.5，其最佳pH值为7.5。>
7.根据权利要求1所述凝血酶原激活方法，步骤3)中所述除菌过滤步骤，凝血酶原溶液和激活剂溶液需分别进行除菌过滤。
8.根据权利要求1所述凝血酶原激活方法，步骤3)中所述的凝血酶原激活剂为1mol/l氯化钙溶液，待激活凝血酶原溶液最终钙离子浓度范围为20～60mmol/l，其最佳浓度为40mmol/l。
9.根据权利要求1所述凝血酶原激活方法，步骤3)中所述凝血酶原激活的温度范围为0～10℃，激活的时间范围为6～15天。
10.根据权利要求1所述的血浆既可以是人血浆也可以猪或牛等动物来源的血浆。
...【技术特征摘要】
1.本发明涉及一种凝血酶原提取及激活的方法，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述凝血酶原提取方法，步骤1)中所述阴离子交换树脂为deaesephadex-a50，每吨血浆所得洗脱液范围为50～100l。
3.根据权利要求1所述凝血酶原提取方法，步骤2)中所述超滤膜截留孔径大小为5kd或10kd或30kd，所用超滤缓冲液为注射用水，所用注射用水温度不高于25℃，经超滤后最终溶液的电导率值为0.01～2.50ms/cm。
4.根据权利要求1所述凝血酶原提取方法，步骤2)中所述超滤后凝血酶原溶液中凝血酶原的最终浓度范围为5～15iu/ml,其最佳浓度为10iu/ml。
5.根据权利要求1所述凝血酶原提取方法，步骤2)中所述超滤后凝血酶原溶液中除含有凝血酶原外，还含有凝血因子x，其含量为凝血酶原含量的50％至150...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡吉军，宣桂文，梁海明，庾昌文，李宇星，秦亮，郑炎，
申请(专利权)人：广东双林生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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