【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及发酵工程，特别涉及一种大肠杆菌发酵生产l-精氨酸的方法。
技术介绍
1、l-精氨酸是人体内一种半必需性氨基酸，参与机体生殖发育、免疫力调节、促进人体解毒等多种生理生化过程。因此l-精氨酸作为一种高附加值氨基酸，在动物饲料、保健品和医药制品等领域具有广泛的应用。随着精氨酸市场需求量的不断增长，微生物发酵法己逐步取代蛋白水解法成为大规模工业化生产精氨酸的理想方法。现阶段，精氨酸高产菌株成为限制微生物发酵法生产精氨酸发展的关键因素。
2、目前精氨酸生产菌株的升级主要通过合成途径强化、代谢网络的改造(分支途径的改造，阻断脯氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺的合成，减少代谢流的损失；辅助因子优化，强化ppp途径)以及促进精氨酸的胞外运输等方面来进行。随着合成生物学手段的不断发展，越来越多的代谢工程策略应用于构建精氨酸高效生产的细胞工厂。然而，关注于代谢途径的理性改造虽然目的明确，效果显著，但由于微生物是一个复杂的系统，已知的代谢网络或改造思路并不能进一步达到快速提高产量的目的，因此在获得高产菌株后，工艺的更新并和菌株相配合成为技术优化的关键。
3、下述列举了精氨酸相关技术的部分专利情况，可见现有技术中氨基酸发酵领域主要热点和工艺如下：
4、一种利用流加培养液发酵生产精氨酸的工艺，cn 112430633 b：该专利公开了一种利用流加培养液发酵精氨酸的工艺，在发酵过程中通过流加硫酸铵水溶液以及葡萄糖液生产精氨酸；
5、一株大肠埃希氏菌及其在发酵生产l-精氨酸中的应用，cn 116355814
6、一种流加底物酶制备氨基丁酸的方法，cn108300742a：该专利专利技术公开了一种流加底物酶制备γ-氨基丁酸的方法，将底物谷氨酸钠加入缓冲溶液中配置谷氨酸钠溶液，经过滤后向菌浆中流加谷氨酸钠溶液，控制反应体系中谷氨酸钠浓度为10-45g/l，进行酶合成反应。
7、一种赖氨酸的生产方法，cn104232702b：该专利专利技术了一种赖氨酸的生产方法，该方法包括了流加碳源和氮源以及无机盐，并控制其中多种关键物料在发酵液中的浓度，最终赖氨酸浓度达到180g/l，转化率65％；
8、一种高产酸量l精氨酸发酵过程的调控方法，cn201510211512.7：该专利专利技术了一种黄色短杆菌生产精氨酸的方法，通过fpc控制系统在线控制发酵过程中的温度、搅拌速度、罐压以及发酵不同阶段的ph、溶氧等参数，最终产酸5.8％。
9、目前国内精氨酸发酵已经逐渐开始转向基因工程菌作为生产菌株，大部分专利都主要以菌株构建设计为主，工艺开发较少，而工艺开发专利主要以常规参数以及补料以及氨氮流加为主，针对中间产物以及合成前体控制较少，进而导致精氨酸工程菌产量偏低，工艺稳定性较差等现象，以上不足之处是本领域亟需解决的技术问题。
技术实现思路
1、本专利技术针对现有技术中的不足之处，公开了一种大肠杆菌发酵生产l-精氨酸的方法。通过专利一种提高精氨酸产量的工程菌、生物材料及其应用(cn202311807062.9)获得的一株大肠杆菌突变株为出发菌进行生产工艺开发，并通过控制溶氧、残糖等参数，进一步通过控制谷氨酸前体浓度开发了一种特殊的精氨酸发酵工艺，该工艺精氨酸产量高，糖酸转化率高，杂酸低等特点，解决了精氨酸产业化过程中的控制难点，具有极大的商业价值。
2、首先，本申请所述的生产菌为大肠杆菌突变株；保藏名称为大肠杆菌iberq-115(escherichia coli)保藏编号为cctcc no:m 20241820；其保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路，武汉大学；邮编430072；保藏日期为2024年08月19日。
3、进一步的，所述的大肠杆菌iberq-115(escherichia coli)是以大肠杆菌(mg1655)为出发菌株，通过构建所得，是一种高产l-精氨酸、副酸少的生产菌株。
4、本专利技术提供了含有所述大肠杆菌iberq-115(escherichia coli)的菌剂，包括：大肠杆菌iberq-115(escherichia coli)的菌群、和/或其培养物、和/或其提取物。
5、另外一方面，本申请还公开了所述的大肠杆菌发酵生产l-精氨酸的方法；包括利用大肠杆菌iberq-115(escherichia coli)进行l-精氨酸发酵生产；更优选的，所述方法，主要是根据菌种浓度od600情况，阶段控制发酵液中谷氨酸的浓度，进而大大提高精氨酸的产量；
6、对于上文所述的技术方案，进一步优选的，所述的发酵方法，包括如下步骤：在l-精氨酸发酵过程中的发酵阶段：交替调节转速和通气保持溶氧在30-40％；残糖下降至0.05-0.15g/l时，开始流加补料糖液，并维持发酵液中残糖浓度在0.05-0.15g/l；待菌株浓度od600生长至20-50时，开始流加谷氨酸钠，并控制谷氨酸在0.5-3.0g/l；补料糖液补完且残糖耗尽，下罐。
7、对于上文所述的技术方案，进一步优选的，所述的谷氨酸前体为柠檬酸钠和/或琥珀酸钠。
8、对于上文所述的技术方案，进一步优选的，所述的补料谷氨酸钠的浓度为8-12wt％，所述柠檬酸钠为8-12wt％，所述琥珀酸钠为8-12wt％。
9、对于上文所述的技术方案，进一步优选的，所述补料糖液为40-80wt％葡萄糖液。
10、对于上文所述的技术方案，进一步优选的，当使用谷氨酸钠作为补料物质时，控制发酵液中的谷氨酸浓度在1.0-2.0g/l；
11、对于上文所述的技术方案，进一步优选的，当使用柠檬酸钠或琥珀酸钠作为补料物质时，控制发酵液中的谷氨酸浓度在0.5-1.5g/l。
12、对于上文所述的技术方案，进一步优选的，所述的发酵方法，包括如下步骤：将二级种子液以5-15％接种至发酵罐中(此时发酵液中的谷氨酸浓度几乎为0)；在34-37℃、ph6.6-7.0、转速150-250rpm、通气量50-150lpm、罐压0.02-0.08mpa的条件下发酵，初始发酵装液量为50-70％
13、对于上文所述的技术方案，进一步优选的，在所述的发酵阶段还包括如下步骤：一级种子液成熟标志：od600为2.0-2.5；二级种子液成熟标志：od600为6-12。
14、对于上文所述的技术方案，进一步优选的，所述二级种子液的制备，包括下述步骤：将大肠杆菌iberq-115接入一级种子培养基中，30-40℃，100-250rpm，得到摇瓶种子液，一级种子液成熟标志：od600为2.0-2.5；
15、将摇瓶种子液以0本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种发酵生产L-精氨酸的方法，其特征在于：利用保藏编号为CCTCC NO:M 20241820的大肠杆菌IBERQ-115(Escherichia coli)进行L-精氨酸发酵生产。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：根据菌种浓度OD600情况，阶段控制发酵液中的谷氨酸浓度。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：在L-精氨酸发酵过程中的发酵阶段：交替调节转速和通气保持溶氧在30-40％；残糖下降至0.05-0.15g/L时，开始流加补料糖液，并维持发酵液中残糖浓度在0.05-0.15g/L；待菌株浓度OD600生长至20-50时，开始流加谷氨酸钠或谷氨酸前体，并控制谷氨酸在0.5-3.0g/L；补料糖液补完且残糖耗尽，下罐。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的谷氨酸前体为柠檬酸钠和/或琥珀酸钠。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的补料谷氨酸钠的浓度为8-12wt％，所述柠檬酸钠为8-12wt％，所述琥珀酸钠为8-12wt％。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述补料
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：在所述的发酵阶段还包括如下步骤：将二级种子液以5-15％接种至发酵罐中；在34-37℃、pH 6.6-7.0、转速150-250RPM、通气量50-150LPM、罐压0.02-0.08Mpa的条件下发酵，初始发酵装液量为50-70％。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：在所述的发酵阶段还包括如下步骤：一级种子液成熟标志：OD600为2.0-2.5；二级种子液成熟标志：OD600为6-12。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的发酵过程中，菌株浓度OD600生长至30-40时，开始流加谷氨酸钠，并控制谷氨酸在1-2g/L。
10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的步骤(1)中使用的培养基包括：一级种子培养基：甘油0.5-1.5wt％，蛋白胨0.5-1.5wt％，酵母粉0.3-0.7wt％，KH2PO4 0.3-0.5wt％，磷酸氢二铵0.1-0.3/4wt％，硫酸镁0.1-0.3wt％，pH 6.5-7.0；
...【技术特征摘要】
1.一种发酵生产l-精氨酸的方法，其特征在于：利用保藏编号为cctcc no:m 20241820的大肠杆菌iberq-115(escherichia coli)进行l-精氨酸发酵生产。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：根据菌种浓度od600情况，阶段控制发酵液中的谷氨酸浓度。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：在l-精氨酸发酵过程中的发酵阶段：交替调节转速和通气保持溶氧在30-40％；残糖下降至0.05-0.15g/l时，开始流加补料糖液，并维持发酵液中残糖浓度在0.05-0.15g/l；待菌株浓度od600生长至20-50时，开始流加谷氨酸钠或谷氨酸前体，并控制谷氨酸在0.5-3.0g/l；补料糖液补完且残糖耗尽，下罐。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的谷氨酸前体为柠檬酸钠和/或琥珀酸钠。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的补料谷氨酸钠的浓度为8-12wt％，所述柠檬酸钠为8-12wt％，所述琥珀酸钠为8-12wt％。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘军，范超，洪皓，齐佳琨，陈剑彬，吴文忠，
申请(专利权)人：大连医诺生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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