【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种高效制备不同分子量的pdrn的技术。
技术介绍
1、多聚脱氧核糖核苷酸（pdrn）是一类有活性的多聚核苷酸混合物，分子量范围50-2000bp，从人体胎盘或者精细胞中可以提取到少量的pdrn，但是由于原材料取材受限， 目前主要是从鲑科鱼的精液或者精巢组织中提取。研究表明pdrn通过与腺苷a2a受体结合，启动多种信号通路，增加抗炎因子，减少炎症因子，抑制炎症反应；还可以通过补救途径，提供嘌呤或者嘧啶，加速dna的合成修复受损皮肤；另外还能促进成骨细胞活性，胶原蛋白合成和血管再生。目前pdrn作为一种化妆品及医药原料，在医疗美容、化妆品、医疗器械、保健食品以及医药领域的应用越来越广泛。不同长度的dna片段，发挥的功效有所不同，化妆品和食品级的pdrn片段长度约50-100bp，而药品级的pdrn片段长度约500bp-800bp，医疗器械级的pdrn片段长度大于1000bp。
2、pdrn的生产过程主要包括dna提取、dna片段断裂和dna纯化后处理等，其中dna的断裂方法有酸解、碱解、超声波处理以及限制性内切酶或者dnasei酶解法。专利kr100986603公开了一种pdrn的制备方法，该方法需要再不锈钢高压设备反应釜内加热至100-109℃条件高温灭菌，同时在68-72℃加醋酸/盐酸混合液对dna进行酸解降低分子量，再通过32%氢氧化钠溶液调ph至中性，在此条件下易发生美拉德反应，导致产品颜色发黄，同时对设备要求较高。专利cn110747194a公开了一种pdrn的制备方法，该专利技术
技术实现思路
1、本专利技术的为了制备不同分子量pdrn，公开了一种制备不同分子量pdrn的方法，制备方法如下：取鲑科鱼精巢，通过蛋白酶k酶解鱼精细胞，使用超声波对酶解液进行预处理，对预处理后的样品通过核酸内切酶进行酶解，从而得到目标分子量的pdrn。具体方法如下：
2、（1）鱼精巢预处理：冷冻鲑鱼精巢在纯水中化冻，冲洗干净，去除血管，沥干水分，粉碎成糊状；
3、（2）鱼精细胞酶解：取1 kg糊状物，按照m:v=1：10的比例，应加入10 l酶解液，按照0.125 g/l浓度加入蛋白酶k，37°c，180 rpm反应过夜；
4、（3）除蛋白：加入8-10%的sds（w/v）、终浓度为2.5m的nacl溶液，继续搅拌3-5h后离心除沉淀，收集上清液；
5、（4）超声波预处理：对收集的上清液进行预冷，使用超声波破碎仪进行dna片段的打断，避免过热发生美拉德反应；
6、（5）酶解：对超声预处理后的溶液通过10-50mg/l核酸内切酶进行酶解，酶解时间为 4h-10h。
7、进一步改进在于，使用超声波破碎仪进行dna片段的打断，与酶解配合可得到不同分子量的pdrn；具体是50-150焦耳，处理 1min-1.5min，可得2000-4000bp 的pdrn； 180-250焦耳，处理1min-2min，可得1000-2000bp 的pdrn；250-350焦耳，处理 1min-2.5min，可得500-1000bp的pdrn。
8、进一步改进在于，方法（2）中的酶解使用的酶可以是脱氧核糖核酸酶、限制性内切酶中的任意一种。
9、进一步改进在于，方法（5）中对超声预处理后的溶液进行酶解的使用dnasei酶。
10、进一步改进在于，所述dnasei酶使用30mg/l，酶解时间为 6h。
11、优选的，在上述操作处理后还包括如下步骤：一次醇沉、复溶过滤、二次醇沉、醇洗和冻干。
12、具体操作步骤如下：步骤一，一次醇沉：酶解结束后，用1倍体积无水乙醇进行醇沉，搅拌均匀后静置， 4500 rpm，10 min离心，收集湿固体；步骤二，复溶过滤：按照10 g/l把湿固体用超纯水复溶，用过滤器进行溶液的过滤，收取样品溶液；步骤三，向样品溶液中加入2倍无水乙醇进行醇沉，离心得到沉淀，得到pdrn湿固体；步骤四，二次醇沉沉淀用粉碎机进行粉碎，80%乙醇洗涤粉碎的沉淀3次；步骤五，湿固体直接冷冻干燥，粉碎，得到冻干的白色粉末样品。
13、进一步改进在于，步骤二中，用0.2-3μm深层过滤器进行溶液的过滤。
14、本专利技术还公开了通过上述制备方法获取的pdrn在食品、护肤、医美、医药领域的应用。
15、1. 本专利技术解决了现有技术pdrn分子量单一的问题。本专利技术通过超声波处理结合dnasei酶解的方式，通过改变超声波处理的功率和时间，dnasei的酶量和酶解条件，可以精准的制备不同分子量范围的产品。该过程通过超声波预处理，有效地降低了dnasei的用量及酶解的时间，并避免酸解或碱解过程中的美拉德反应。
16、2、本专利技术的制备方法可实现分子量范围集中于500-1000bp、1000-2000bp、2000-4000bp，有效地避免了分子量范围较宽且不集中片段的产生，产品规格相对集中。实验结果可见附图1-2。
17、3、本专利技术制备的产品为白色粉末，不发黄，蛋白含量低，提高了产品的质量和附加值。
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1.一种制备不同分子量PDRN的方法，其特征在于，制备方法如下：取鲑科鱼精巢，通过蛋白酶K酶解鱼精细胞，使用超声波对酶解液进行预处理，对预处理后的样品通过核酸内切酶进行酶解，从而得到目标分子量的PDRN。
2.如权利要求1所述的一种制备不同分子量PDRN的方法，其特征在于，具体方法如下：
3.如权利要求2所述的一种制备不同分子量PDRN的方法，其特征在于，超声波预处理方法为：
4.如权利要求2所述的一种制备不同分子量PDRN的方法，其特征在于，方法（2）中的酶解使用的酶可以是脱氧核糖核酸酶、限制性内切酶中的任意一种。
5.如权利要求2所述的一种制备不同分子量PDRN的方法，其特征在于，方法（5）中对超声预处理后的溶液进行酶解的使用DNaseI酶。
6.如权利要求5所述的一种制备不同分子量PDRN的方法，其特征在于，所述DNaseI酶使用30mg/L，酶解时间6h。
7.如权利要求2所述的一种制备不同分子量PDRN的方法，其特征在于，酶解处理后还包括如下步骤：一次醇沉、复溶过滤、二次醇沉、醇洗和冻干。
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1.一种制备不同分子量pdrn的方法，其特征在于，制备方法如下：取鲑科鱼精巢，通过蛋白酶k酶解鱼精细胞，使用超声波对酶解液进行预处理，对预处理后的样品通过核酸内切酶进行酶解，从而得到目标分子量的pdrn。
2.如权利要求1所述的一种制备不同分子量pdrn的方法，其特征在于，具体方法如下：
3.如权利要求2所述的一种制备不同分子量pdrn的方法，其特征在于，超声波预处理方法为：
4.如权利要求2所述的一种制备不同分子量pdrn的方法，其特征在于，方法（2）中的酶解使用的酶可以是脱氧核糖核酸酶、限制性内切酶中的任意一种。
5.如权利要求2所述的一种制备不同分子量pdrn的方法，其特征在于，方法（5）中对超声预处理...
【专利技术属性】
技术研发人员：邰玉凯，潘尚书，徐国权，
申请(专利权)人：南京乐韬生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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