一种重组质粒的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种重组质粒的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：(1)将重组质粒转化进入大肠杆菌感受态细胞中，然后在25～35℃下培养并筛选单克隆；(2)将筛选得到的单克隆在25～35℃下发酵，或先在25～35℃下发酵，再在40～45℃下发酵，所述发酵采用的碳源为甘油。相较于传统转化筛选和发酵工艺，本发明专利技术通过使用特定的感受态细胞，结合全程中温度控制、发酵碳源选择，降低或控制菌株前期生长速率可以降低小质粒杂质的产生，进一步结合特定的培养基以及发酵条件控制，在避免产生小质粒杂质的同时降低对质粒表达量的影响，从而获得高品质质粒。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程，具体涉及一种重组质粒的制备方法。

技术介绍

0、背景

1、随着生物医药行业的不断发展，我国细胞与基因治疗领域研发与应用正加速崛起，高质量、高纯度的质粒是细胞和基因治疗过程中的关键组成部分，其广泛应用于裸质粒、dna疫苗、mrna及病毒载体的开发，作为前端的材料，其高质量和高纯度可以为后续的开发提供保障。由于质粒存在重复片段、polya/t片段或质粒在宿主中表达蛋白具有一定毒性，导致质粒在宿主菌种结构的不稳定，在发酵扩大培养过程中，质粒的复制合成过程中易丢失部分片段，从而产生小于原始质粒的小质粒杂质。小质粒杂质其一级结构与目标质粒具有一定的差异，目标质粒作为病毒包装质粒时，小质粒杂质会严重影响到转染的效率，目标质粒作为mrna质粒时，小质粒杂质会严重影响ivt产率，并进一步影响后续的体内疗效。

2、在目前的重组质粒大规模发酵制备工艺中，基本只能通过优化原始质粒的骨架和目的基因的序列来避免或尽量降低发酵生产时的小质粒杂质，这种方式周期长，且不能保证优化后的质粒骨架及序列能够完全避免小质粒杂质的产生。在目前的生产工本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种重组质粒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌感受态细胞为DH5α感受态细胞或Stable感受态细胞。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，在28～32℃下培养并筛选单克隆。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，将筛选得到的单克隆在28～32℃下发酵，或先在28～32℃下发酵，再在40～42℃下发酵。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，从发酵开始至OD600达到30期间，...

【技术特征摘要】

1.一种重组质粒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌感受态细胞为dh5α感受态细胞或stable感受态细胞。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，在28～32℃下培养并筛选单克隆。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，将筛选得到的单克隆在28～32℃下发酵，或先在28～32℃下发酵，再在40～42℃下发酵。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，从发酵开始至od600达到30期间，在28～32℃下发酵；od600为30至发酵结束期间，在40～42℃下发酵。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，先将单克隆接种至发酵底料中进行发酵培养，然后连续加入补料培养基进行连续补料发酵培养。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述发酵底料配方为：甘油10～50g/l，酵母提取物10～30g/...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊淑婷，杨薇，彭木，李光勇，汪云飞，任科云，王潇，
申请(专利权)人：楷拓生物科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：