【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及一种冷休克诱导自溶型酿酒酵母及其构建方法和应用。
技术介绍
1、化妆品是以合成或者天然提取的各种作用不同物质作为原料，经加热、搅拌和乳化等生产程序加工而成的混合物，其原料种类繁多，性能各异。近年来以生物发酵产物为原料的化妆品备受消费者青睐。时至今日，以酵母发酵滤液为首的化妆品原料尚不能通过人工合成，只能通过在特定环境、特定压力、特定温度、特定工艺中提纯出来。因此更优质的发酵菌株是广大化妆品原料生产商们所急需的。
2、酿酒酵母是一种广泛应用于酿酒行业的天然酵母，广泛存在于白酒酿造行业使用的酒曲中，可作为酒曲发酵时的辅助发酵微生物，从而为酒曲添加更丰富的风味物质。同时酿酒酵母是fda公认的食品级安全酵母菌，且最近几年已被收录至中国化妆品原料名录中，其优势在于可作为发酵碳源的来源广泛，发酵条件宽松，产出活性物质的量较多，因此近年来酿酒酵母作为可生产化妆品原料的工程菌备受众多化妆品大厂的追捧。
3、提高酵母菌发酵产物滤液活性物质含量的方法是使菌体发生细胞壁破裂释放胞内物质。发酵工程中常采用两种工艺：一是高温，酿酒酵母在45-60℃下长时间培养会发生自溶现象，在超过100℃的高温下其完整的细胞壁结构也会被破坏，无法支撑酵母的形态导致胞内物质流出，这有利于制作产物更加丰富的酵母发酵滤液。但高温容易影响酿酒酵母中的部分活性物质，使之发生变性或者损失，这对化妆品原料的品质影响极大，且该生产流程耗能极高。二是酶解，传统的发酵工艺采用酶解的方式分解酵母细胞的细胞壁，缺少细胞壁保护作用的酵母细胞会逐渐破
4、因此，亟需提供一种冷休克诱导自溶型酿酒酵母及构建方法，实现一次冷休克(0-10℃)即可诱导工程菌发生显著自溶。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种冷休克诱导自溶型酿酒酵母及其构建方法和应用，该重组酵母工程菌发酵后，通过一次冷休克即可诱导工程菌发生显著自溶，同时反应产物无需高温灭菌，杜绝了滤液中多糖与蛋白在高温条件下发生美拉德反应造成的褐化现象。本专利技术具有设备简单、容易操作、安全性高等优点，具备无需其他试剂，对环境友好，成本低，性价比高的特点。
2、为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供了一种冷休克诱导自溶型酿酒酵母，所述冷休克诱导自溶型酿酒酵母表达编码分解细胞壁组分的基因，所述编码分解细胞壁组分的基因包括内切β-1,3-葡聚糖酶的编码基因bgl2、几丁质酶编码基因cts1和β-甘露聚糖酶的编码基因mana；所述编码分解细胞壁组分的基因的启动子为冷休克诱导型启动子。
4、本专利技术制备得到的冷休克诱导自溶型酿酒酵母通过一次冷休克(0℃-10℃)即可诱导工程菌发生显著自溶，同时反应产物无需高温灭菌，杜绝了滤液中多糖与蛋白在高温条件下发生美拉德反应造成的褐化现象。
5、本专利技术中，所述编码分解细胞壁组分的基因可以共用一个启动子，也可以分别与启动子连接构建不同质粒用于转化。
6、优选地，所述编码分解细胞壁组分的基因还包括酸性蛋白酶的编码基因pep4。
7、优选地，所述冷休克诱导型启动子包括pcctα。
8、优选地，所述冷休克诱导型启动子的核酸序列包括如seq id no.1所示的序列。
9、优选地，所述冷休克诱导型启动子的来源包括酿酒酵母。
10、优选地，所述内切β-1,3-葡聚糖酶的编码基因bgl2的核酸序列包括如seq idno.2所示的序列。
11、优选地，所述内切β-1,3-葡聚糖酶的编码基因bgl2的来源包括酿酒酵母。
12、优选地，所述几丁质酶编码基因cts1的核酸序列包括如seq id no.3所示的序列。
13、优选地，所述几丁质酶编码基因cts1的来源包括酿酒酵母。
14、优选地，所述β-甘露聚糖酶的编码基因mana的核酸序列包括如seq id no.4所示的序列。
15、优选地，所述β-甘露聚糖酶的编码基因mana的来源包括构巣曲霉。
16、优选地，所述酸性蛋白酶的编码基因pep4的核酸序列包括如seq id no.5所示的序列。
17、优选地，所述酸性蛋白酶的编码基因pep4的来源包括酿酒酵母。
18、酸性蛋白酶基因pep4可编码一种无活性液泡天冬氨酸蛋白酶，即酵母蛋白酶a。内切β-1,3-葡聚糖酶的编码基因bgl2、几丁质酶编码基因cts1和β-甘露聚糖酶的编码基因mana的表达产物能裂解酿酒酵母细胞壁多糖并导致细胞自溶。酿酒酵母内含的液泡因渗透压变化而破裂并释放相关因子，酵母蛋白酶a会与从液泡释放出的相关因子结合产生酸性蛋白酶活性，在酸性环境下(ph<4.0)将其他蛋白(包括内切β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶和β-甘露聚糖酶)一并水解，生成更多氨基酸。
19、seq id no.1：
20、aagtccacgcagtaccctgcataatcatgtattaccataaaaaggctttaatatgagaaaaaggtgagcgctatatagatttagtaatttacatgttacagaagcaaaaagcaaatatatatatattttttatcatattagtttttatcctcagtagtactactgaaataataatctcagatttttttttttcacttgccgagggaccttgtcctaagtggcaaagaactgaaaaaaaaaaaaattgaaatgcggtggtatcacatgaagagtaaataacttaagcaaaagagaggccactgagagagtacaagaaagggacaataacaatagacagaagacttttatatttgtaataacttagcg。
21、seq id no.2：
22、atgcgtttctctactacactcgctactgcagctactgcgctatttttcacagcctcccaagtttcagctattggtgaactagcctttaacttgggtgtcaagaacaacgatggtacttgtaagtccacttccgactatgaaaccgaattacaagctttgaagagctacacttccaccgtcaaagtttacgctgcctcagattgtaacactttgcaaaacttaggtcctgctgctgaagctgagggatttactatctttgtcggtgtttggccaacagacgacagtcattacgctgctgaaaaggctgctttgcaaacctatttgccaaaaattaaagaatccactgttgctggtttcttggttgg本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种冷休克诱导自溶型酿酒酵母，其特征在于，所述冷休克诱导自溶型酿酒酵母表达编码分解细胞壁组分的基因，所述编码分解细胞壁组分的基因包括内切β-1,3-葡聚糖酶的编码基因bgl2、几丁质酶编码基因cts1和β-甘露聚糖酶的编码基因manA；
2.根据权利要求1所述的冷休克诱导自溶型酿酒酵母，其特征在于，所述编码分解细胞壁组分的基因还包括酸性蛋白酶的编码基因pep4。
3.根据权利要求1或2所述的冷休克诱导自溶型酿酒酵母，其特征在于，所述冷休克诱导型启动子包括pCCTα；
4.根据权利要求1-3中任一项所述的冷休克诱导自溶型酿酒酵母，其特征在于，所述内切β-1,3-葡聚糖酶的编码基因bgl2的核酸序列包括如SEQ ID NO.2所示的序列；
5.根据权利要求1-4中任一项所述的冷休克诱导自溶型酿酒酵母，其特征在于，所述几丁质酶编码基因cts1的核酸序列包括如SEQ ID NO.3所示的序列；
6.根据权利要求1-5中任一项所述的冷休克诱导自溶型酿酒酵母，其特征在于，所述β-甘露聚糖酶的编码基因manA的核酸序列包括如SEQ
7.根据权利要求2-6中任一项所述的冷休克诱导自溶型酿酒酵母，其特征在于，所述酸性蛋白酶的编码基因pep4的核酸序列包括如SEQ ID NO.5所示的序列；
8.一种构建权利要求1-7中任一项所述的冷休克诱导自溶型酿酒酵母的方法，其特征在于，所述方法包括：
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述冷休克诱导型启动子包括pCCTα；
10.权利要求1-7中任一项所述的冷休克诱导自溶型酿酒酵母在制备化妆品和发酵产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种冷休克诱导自溶型酿酒酵母，其特征在于，所述冷休克诱导自溶型酿酒酵母表达编码分解细胞壁组分的基因，所述编码分解细胞壁组分的基因包括内切β-1,3-葡聚糖酶的编码基因bgl2、几丁质酶编码基因cts1和β-甘露聚糖酶的编码基因mana；
2.根据权利要求1所述的冷休克诱导自溶型酿酒酵母，其特征在于，所述编码分解细胞壁组分的基因还包括酸性蛋白酶的编码基因pep4。
3.根据权利要求1或2所述的冷休克诱导自溶型酿酒酵母，其特征在于，所述冷休克诱导型启动子包括pcctα；
4.根据权利要求1-3中任一项所述的冷休克诱导自溶型酿酒酵母，其特征在于，所述内切β-1,3-葡聚糖酶的编码基因bgl2的核酸序列包括如seq id no.2所示的序列；
5.根据权利要求1-4中任一项所述的冷休克诱导自溶型酿酒...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙瑞林，徐能锋，罗建锟，肖鹏清，赵楚静，李雯倩，
申请(专利权)人：广东丽研生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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