【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种弧菌外膜蛋白多表位抗原，尤其是涉及一种弧菌外膜蛋白a多表位抗原及其重组抗原的制备方法和应用。
技术介绍
1、弧菌病(vibriosis)是一类由弧菌属细菌引起的细菌性疾病，该类病在全球范围内经常发生，其暴发性流行不仅给海水养殖鱼类、甲壳类及贝类等经济动物的养殖业造成巨大的经济损失，还会导致野生的海水鱼类、甲壳类、贝类和海参的大规模死亡，是海水水产养殖业危害最大的细菌性疾病之一。因此，对弧菌病及其病原进行研究和防治是国内外病害工作者的核心问题。据报道，灿烂弧菌(vibriosplendidus)、溶藻弧菌(vibrioalginolyticus)和副溶血弧菌(vibrioparahaemolyticus)等是对虾、贝类和海参、海水鱼类的主要致病原，常引发体表发炎、肝脏褪色充血等症状，感染刺参可造成其肠道壁变脆、肠腔出现大量黄白色粘液或脓状物的“肠炎”症状。基于水产病原菌的高致病性，快速灵敏的检测和预警海洋病原菌对水产和人类健康势在必行。
2、革兰氏阴性细菌中的外膜蛋白(omp)与多种特性相关，包括膜生物发生、跨细胞膜的运输和信号传导。这些蛋白质由跨膜β-桶以及周质和细胞外环组成。已知许多omp在宿主-病原体相互作用和宿主免疫反应中发挥作用，具有良好的抗原性以及表面暴露性，是作为抗原的最佳选择。ompa是革兰氏阴性菌最主要的外膜蛋白之一，由于ompa蛋白在致病菌中具有较高的拷贝数和表面暴露，研究表明ompa积极参与多种致病作用，致病作用包括黏附于粘膜表面、血清抵抗、侵袭、抗菌肽导入和宿主细胞激活。此外，
3、表位，又称抗原决定簇，是存在于抗原表面的、决定抗原特异性的特殊性结构的化学基团。单个抗原分子可具有一种或多种不同的表位，每种表位只有一种抗原特异性。因此，表位是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应具有特异性的基础，其性质、数目和空间构型决定着抗原的特异性。
4、微量热泳动(microscale thermophoresis，简写为mst)技术，是一种简单、快速、精确定量生物分子相互作用的方法。它可以测量分子在微观温度梯度场中的运动，以及检测分子水化层、电荷和大小的改变，从而定量检测生物分子间的相互作用。当进行mst实验的时候，样品由红外激光加热产生一个微观的温度梯度场，再通过共价结合的荧光染料来监测和定量分子的定向运动。应用范围包括小分子的结合行为，蛋白与蛋白之间的相互作用以及蛋白复合体之间的相互作用等。利用生物信息学技术和在线预测软件分析可对生物分子表面抗原表位进行预测，进而利用多表位抗体实现多种弧菌病原的快速检测。目前，国内外还没有公开关于设计并表达了灿烂弧菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌三种水产常见病原弧菌外膜蛋白ompa的多表位抗原，并结合微量热泳动技术检测弧菌的相关研究报道。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是提供一种检测速度快且特异性强的弧菌外膜蛋白a多表位抗原及其重组抗原的制备方法和应用。
2、本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种弧菌外膜蛋白a多表位抗原，利用多表位技术设计出灿烂弧菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌的外膜蛋白合成的多表位抗原序列，其氨基酸序列为seq id no.4所示。
3、本专利技术还提供一种弧菌外膜蛋白a多表位重组抗原的制备方法，具体步骤为：将上述弧菌外膜蛋白a多表位抗原氨基酸序列转换成核苷酸序列，合成弧菌外膜蛋白a基因后克隆到pet-19t克隆载体上，然后酶切连接到pet-28a(+)表达载体上，将含有弧菌外膜蛋白a基因的质粒转化至蛋白表达型感受态细胞bl21(de3)中，筛选出阳性克隆并进行蛋白表达，利用亲和层析法进行蛋白纯化得到弧菌外膜蛋白a多表位重组抗原。
4、进一步，具体步骤如下：将上述弧菌外膜蛋白a多表位抗原氨基酸序列转换成核苷酸序列，合成弧菌外膜蛋白a基因后克隆到pet-28a(+)克隆载体上，然后酶切连接到pet-28a(+)表达载体上，将含有弧菌外膜蛋白a基因的质粒转化至蛋白表达型感受态细胞bl21(de3)中筛选出阳性克隆，将阳性克隆接于大肠杆菌液体培养基中在37℃、120r/min条件下培养至菌液od600为0.4～0.6时，加入终浓度为0.5mm的iptg 37℃诱导5h，促进多表位抗原的大量表达；诱导结束后，以10000r/min的转速离心5min，弃掉大肠杆菌液体培养基，菌体用10倍缓冲溶液重悬后，用纳米高压均质机在55～65mpa的压力下低温破碎，于4℃，10000r/min离心20min，将上清液倒入镍柱1～2h后，用含有70mm咪唑冲洗杂蛋白至蛋白峰降至平稳后，更换500mm咪唑收集洗脱液，得到弧菌外膜蛋白a多表位重组抗原，其中缓冲溶液配方为25mm tris，150mm nacl，ph＝8.0。
5、本专利技术还提供一种上述制备方法得到的弧菌外膜蛋白a多表位重组抗原在制备多表位抗体方面的应用，多表位抗体制备方法步骤如下：将弧菌外膜蛋白a多表位重组抗原首次免疫与弗氏完全佐剂混匀，之后三次免疫与弗氏不完全佐剂混匀，采用腹腔注射的方式对小鼠进行免疫，免疫4次后进行取血，获得免疫小鼠血清，即多表位抗体。
6、本专利技术还提供一种利用上述制备方法得到的多表位抗体检测待测样品液中弧菌的方法，以多表位抗体作为标记蛋白，利用微量热泳动技术检测待测样品液中弧菌，具体步骤如下：
7、(1)将赖氨酸red-nhs二代染料与nhs标记缓冲液等体积混合后，用移液枪轻轻吸打混合均匀，得到终浓度为300μm的染料溶液；
8、(2)将浓度为10μm的多表位抗体与浓度为300μm的染料溶液按体积比9:1的比例混合后，移液枪轻轻吹打混匀，室温下黑暗处避光30min，得到染料-抗体蛋白标记反应溶液；
9、(3)将100μl染料-抗体蛋白标记反应溶液转移至平衡好的蛋白纯化柱中心的树脂上，待液体完全进入树脂，取550μl结合缓冲液加入柱内，洗脱完后，再取450μl结合缓冲液加入柱内，收集洗脱液得到标定好的抗体蛋白；
10、(4)将标定好的抗体蛋白加入含有弧菌的待测样品液，利用微量热泳动仪中的红光检测程序和mo-k022毛细管，在400-800a.u荧光强度下进行检测，根据抗体和抗原的亲和力大小判断待测样品中弧菌的种类。
11、进一步，步骤(3)中所述的结合缓冲液为ph＝7.4的0.01m的磷酸缓冲液。
12、进一步，步骤(4)中当微量热泳动仪上显示亲和力信噪比为9.7时，待测样品液中含有溶藻弧菌，当亲和力信噪比为7.2时，待测样品液中含有灿烂弧菌，当亲和力信噪比为5.3时，待测样品液中含有副溶血弧菌。
13、与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术一种弧菌外膜蛋白a多表位抗原及其重组抗原的制备方法和应用，选择灿烂弧菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种弧菌外膜蛋白A多表位抗原，其特征在于：利用多表位技术设计出灿烂弧菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌的外膜蛋白合成的多表位抗原序列，其氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示。
2.一种弧菌外膜蛋白A多表位重组抗原的制备方法，其特征在于具体步骤为：将权利要求1所述的弧菌外膜蛋白A多表位抗原氨基酸序列转换成核苷酸序列，合成弧菌外膜蛋白A基因后克隆到pET-19T克隆载体上，然后酶切连接到pET-28a(+)表达载体上，将含有弧菌外膜蛋白A基因的质粒转化至蛋白表达型感受态细胞BL21(DE3)中，筛选出阳性克隆并进行蛋白表达，利用亲和层析法进行蛋白纯化得到弧菌外膜蛋白A多表位重组抗原。
3.根据权利要求2所述的一种弧菌外膜蛋白A多表位重组抗原的制备方法，其特征在于具体步骤如下：将权利要求1所述的弧菌外膜蛋白A多表位抗原氨基酸序列转换成核苷酸序列，合成弧菌外膜蛋白A基因后克隆到pET-28a(+)克隆载体上，然后酶切连接到pET-28a(+)表达载体上，将含有弧菌外膜蛋白A基因的质粒转化至蛋白表达型感受态细胞BL21(DE3)中筛选出阳性克隆，将阳性克隆接于大肠杆菌液
4.一种权利要求2所述制备方法得到的弧菌外膜蛋白A多表位重组抗原在制备多表位抗体方面的应用，其特征在于多表位抗体制备方法步骤如下：将弧菌外膜蛋白A多表位重组抗原首次免疫与弗氏完全佐剂混匀，之后三次免疫与弗氏不完全佐剂混匀，采用腹腔注射的方式对小鼠进行免疫，免疫4次后进行取血，获得免疫小鼠血清，即多表位抗体。
5.一种利用权利要求4所述制备方法得到的多表位抗体检测待测样品液中弧菌的方法，其特征在于以多表位抗体作为标记蛋白，利用微量热泳动技术检测待测样品液中弧菌，具体步骤如下：
6.根据权利要求5所述的利用多表位抗体检测待测样品液中弧菌的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的结合缓冲液为pH＝7.4的0.01M的磷酸缓冲液。
7.根据权利要求5所述的利用多表位抗体检测待测样品液中弧菌的方法，其特征在于：步骤(4)中当微量热泳动仪上显示亲和力信噪比为9.7时，待测样品液中含有溶藻弧菌，当亲和力信噪比为7.2时，待测样品液中含有灿烂弧菌，当亲和力信噪比为5.3时，待测样品液中含有副溶血弧菌。
...【技术特征摘要】
1.一种弧菌外膜蛋白a多表位抗原，其特征在于：利用多表位技术设计出灿烂弧菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌的外膜蛋白合成的多表位抗原序列，其氨基酸序列为seq id no.4所示。
2.一种弧菌外膜蛋白a多表位重组抗原的制备方法，其特征在于具体步骤为：将权利要求1所述的弧菌外膜蛋白a多表位抗原氨基酸序列转换成核苷酸序列，合成弧菌外膜蛋白a基因后克隆到pet-19t克隆载体上，然后酶切连接到pet-28a(+)表达载体上，将含有弧菌外膜蛋白a基因的质粒转化至蛋白表达型感受态细胞bl21(de3)中，筛选出阳性克隆并进行蛋白表达，利用亲和层析法进行蛋白纯化得到弧菌外膜蛋白a多表位重组抗原。
3.根据权利要求2所述的一种弧菌外膜蛋白a多表位重组抗原的制备方法，其特征在于具体步骤如下：将权利要求1所述的弧菌外膜蛋白a多表位抗原氨基酸序列转换成核苷酸序列，合成弧菌外膜蛋白a基因后克隆到pet-28a(+)克隆载体上，然后酶切连接到pet-28a(+)表达载体上，将含有弧菌外膜蛋白a基因的质粒转化至蛋白表达型感受态细胞bl21(de3)中筛选出阳性克隆，将阳性克隆接于大肠杆菌液体培养基中在37℃、120r/min条件下培养至菌液od600为0.4～0.6时，加入终浓度为0.5mm的iptg 37℃诱导5h；诱导结束后，以10000r/min的转速离心5min，弃掉大肠杆菌液体培养基，菌体用10倍缓冲溶液重悬后，用纳米高压均...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。