布鲁氏菌效应蛋白BspE基因缺失株的构建方法及应用方法技术

本发明专利技术属于但不限于基因工程技术技术领域，公开了一种布鲁氏菌效应蛋白BspE基因缺失株的构建方法及应用，利用同源重组及SacB反向筛选技术构建BspE基因缺失株，以牛种布鲁氏菌A19疫苗株菌液为模板，PCR扩增得到BspE基因上、下游同源臂，将胶回收的BspE基因上、下游同源臂进行融合PCR扩增，将获得的融合片段与pUC19‑SacB质粒进行连接、转化，获得重组质粒pUC19‑ΔBspE。将该质粒电转化至牛种布鲁氏菌A19感受态细胞，经卡那抗性及蔗糖压力筛选，PCR鉴定及测序，所得阳性转化子即为牛种布鲁氏菌BspE缺失株，该缺失疫苗毒株提高了抗菌细胞因子及特异性布鲁氏菌抗体IgG的水平，是一种新型的布鲁氏菌候选减毒疫苗毒株，具有较好的市场前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于但不限于基因工程技术，尤其涉及一种布鲁氏菌效应蛋白bspe基因缺失株的构建方法及应用方法。

技术介绍

1、布鲁氏菌病(brucellosis)是一种由布鲁氏菌引起的人畜共患病，对人类健康及畜牧业的经济发展构成了极大的威胁。目前，布鲁氏菌病的防控主要依靠减毒活疫苗，虽然起到了重要的防控作用，但也存在一些问题，如干扰诊断、残存毒力及孕畜流产等。

2、许多胞内寄生菌通过分泌效应蛋白来促进它们在宿主细胞中的生存和增殖。布鲁氏菌通过分泌多种毒力因子逃避机体的免疫应答，在机体内生存和增殖。t4ss是布鲁氏菌重要的毒力因子，其所分泌的效应蛋白对布鲁氏菌在细胞中的生存和感染后的免疫反应具有调控作用。目前已发现17个与t4ss相关的效应蛋白，分别为vcea、vcec、rica、bpe005、bpe043、bpe123、bpe275、btpa、btpb、sepa、bspa、bspb、bspc、bspe、bspf、bspj及bspl，它们在布鲁氏菌感染宿主的过程中发挥着重要作用。

3、在现有的布鲁氏菌病防控技术中，主要存在以下三个问题：...

【技术保护点】

1.一种牛种布鲁氏菌效应蛋白BspE基因缺失株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的牛种布鲁氏菌效应蛋白BspE基因缺失株的构建方法，其特征在于，所述步骤一中的引物包括：

3.如权利要求1所述的牛种布鲁氏菌效应蛋白BspE基因缺失株的构建方法，其特征在于，所述步骤二中扩增条件为：98℃预变性10min；98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min；BspE基因上游同源臂扩增体系为25μL：Primer StarMaxPremix：12.5μL；牛种布鲁氏菌A19菌液：3μL；BspE-up-F：...

【技术特征摘要】

1.一种牛种布鲁氏菌效应蛋白bspe基因缺失株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的牛种布鲁氏菌效应蛋白bspe基因缺失株的构建方法，其特征在于，所述步骤一中的引物包括：

3.如权利要求1所述的牛种布鲁氏菌效应蛋白bspe基因缺失株的构建方法，其特征在于，所述步骤二中扩增条件为：98℃预变性10min；98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min；bspe基因上游同源臂扩增体系为25μl：primer starmaxpremix：12.5μl；牛种布鲁氏菌a19菌液：3μl；bspe-up-f：1μl；bspe-up-r：1μl；ddh2o：7.5μl；bspe基因下游同源臂扩增体系为25μl：primer starmax premix：12.5μl；牛种布鲁氏菌a19菌液：3μl；bspe-down-f：1μl；bspe-down-r：1μl；ddh2o：7.5μl。

4.如权利要求1所述的牛种布鲁氏菌效应蛋白bspe基因缺失株的构建方法，其特征在于，所述步骤三中扩增条件为：98℃预变性10min；98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min；bspe基因上游同源臂扩增体系为25μl：primer starmaxpremix：12.5μl；模板：3μl；bspe-up-f：1μl；bspe-down-r：1μl；ddh2o：7.5μl。

5.如权利要求1所述的牛种布鲁氏菌效应蛋白bspe基因缺失株的构建方法，其特征在于，步骤四的具体操作过程如下：

6.如权利要求1所述的牛种布鲁...

【专利技术属性】
技术研发人员：许健，储岳峰，张思岚，刘立元，郑福英，支飞杰，罗意，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心兰州分中心，
类型：发明
国别省市：