【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体地，涉及一种增强无细胞体系蛋白质表达的信号肽及其应用及其在d2p中的应用。
技术介绍
1、蛋白质是一切生命的物质基础，是机体细胞的重要组成部分。蛋白质在生物、医药领域拥有重要的应用和巨大的价值，比如分子酶(taq酶、pfu酶)、抗体、激素、血红蛋白、胶原蛋白、甜蛋白等等都是蛋白质，这些蛋白质在科研、医药、大健康、美容、食品等领域具有无限的商业价值。蛋白质有如此巨大的应用和前景，如何能够以更低成本大量制备这些蛋白质是一项迫在眉睫的技术问题。传统的方法一般通过大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞进行表达纯化。在应用医药和食品等领域，大肠杆菌面临去内毒素的问题。而酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞生产周期相对较长、成本较高。
2、除了以上人们对于细胞内蛋白质合成的了解之外，蛋白质合成也可以在细胞外进行。蛋白质体外合成系统一般是指在细菌、真菌、植物细胞或动物细胞的裂解体系中，加入mrna或者dna模板、rna聚合酶及氨基酸和atp等组分，完成外源蛋白的快速高效翻译。
3、在体外合成蛋白的过程中，选择合适的信号肽能够增强蛋白表达，从而进一步降低蛋白合成成本。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于是通过基因改造提高无细胞蛋白质表达(dnato protein,d2p)体系的蛋白质表达水平。
2、本专利技术的目的在于提供一种增强无细胞体系表达蛋白的信号肽，将含有该信号肽编码序列的核酸构建物应用于体外蛋白质表达系统中，可以提高外源蛋
3、本专利技术第一方面提供了一种增强无细胞体系表达蛋白的信号肽，其特征在于：所述的信号肽的的氨基酸序列选自下组之一：
4、如seq id no.1～seq id no.72所示的氨基酸序列；
5、所述信号肽编码序列用于连接在外源蛋白的编码序列的n端来增强无细胞体系外源蛋白表达。
6、所述“增强”是指将无细胞表达蛋白的效率和/或产量提高至少1％以上，进一步优选5％以上，更优选10％以上，更优选30％以上，最优选100％以上。
7、所述信号肽来源选自下组中的一种或多种细胞：原核细胞、真核细胞。另一优选例中，所述信号肽来源选自下组选自下组中的一种或多种细胞：人(human)、中国仓鼠卵巢细胞(chinese hamster ovary cell,cho)、昆虫细胞(insect)、麦胚(wheatgerm cells)、兔网织红细胞(rabbit reticulocyte)、酵母细胞。
8、本专利技术第二方面提供一种如第一方面任意一项所述的信号肽的编码序列，一优选例中，所述的信号肽的编码序列选自下组之一；
9、(a)seq id no.73～seq id no.144中任意一项所示的多核苷酸；
10、(b)核苷酸序列与seq id no.73～seq id no.144中任意一项所示序列的同源性≥30％，较佳地，75％(较佳地≥85％，更佳地≥90％或≥95％或≥98％或≥99％)的多核苷酸；
11、(c)在seq id no.73～seq id no.144中任意一项所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短或添加1-20个，更佳地1-10个核苷酸的多核苷酸；
12、(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
13、在另一优选例中，所述外源蛋白的编码序列来自动物、植物、病原体。
14、在另一优选例中，所述外源蛋白的编码序列来自哺乳动物，较佳地灵长动物，啮齿动物，包括人、小鼠、大鼠。
15、在另一优选例中，所述外源蛋白选自可溶性蛋白、功能性蛋白以及活性蛋白的天然蛋白或突变蛋白或人工设计蛋白。
16、在另一优选例中，所述的外源蛋白的编码序列选自下组：编码荧光素蛋白，或荧光素酶(如萤火虫荧光素酶)、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、氨酰trna合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、过氧化氢酶、肌动蛋白、抗体的可变区域的外源dna、荧光素酶突变体的dna或其组合。
17、在另一优选例中，所述外源蛋白选自下组：荧光素蛋白，或荧光素酶(如萤火虫荧光素酶)、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、氨酰trna合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、过氧化氢酶、肌动蛋白、抗体的可变区域、荧光素酶突变、α-淀粉酶、肠道菌素a、丙型肝炎病毒e2糖蛋白、胰岛素前体、干扰素αa、白细胞介素-1β、溶菌酶素、血清白蛋白、单链抗体段(scfv)、甲状腺素运载蛋白、酪氨酸酶、木聚糖酶、或其组合。
18、本专利技术第三方面提供一种核酸构建物，其特征在于，包括本专利技术第二方面任一项所述的信号肽编码序列和外源蛋白编码序列，且所述的信号肽编码序列与外源蛋白的编码序列的n端相连接。
19、进一步地，所述的信号肽编码序列与外源蛋白的编码序列的n端相通过键或者连接序列连接；优选地，所述连接序列为密码子优化的连接序列；更有优选地，所述连接序列具有不易形成二级结构的序列(如at-rich序列，无发卡结构，无g-quadruplex等等)，不富含稀有密码子。
20、在另一优选例中，所述连接序列可带有酶切位点。
21、进一步地，所述外源蛋白的编码序列来自原核生物、真核生物。
22、在另一优选例中，所述外源蛋白的编码序列来自动物、植物、病原体。
23、在另一优选例中，所述外源蛋白的编码序列来自哺乳动物，较佳地灵长动物，啮齿动物，包括人、小鼠、大鼠。
24、在另一优选例中，所述的外源蛋白的编码序列选自下组：编码荧光素蛋白，或荧光素酶(如萤火虫荧光素酶)、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、氨酰trna合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、过氧化氢酶、肌动蛋白、抗体的可变区域的外源dna、荧光素酶突变体的dna或其组合。
25、在另一优选例中，所述外源蛋白选自下组：荧光素蛋白，或荧光素酶(如萤火虫荧光素酶)、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、氨酰trna合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、过氧化氢酶、肌动蛋白、抗体的可变区域、荧光素酶突变、α-淀粉酶、肠道菌素a、丙型肝炎病毒e2糖蛋白、胰岛素前体、干扰素αa、白细胞介素-1β、溶菌酶素、血清白蛋白、单链抗体段(scfv)、甲状腺素运载蛋白、酪氨酸酶、木聚糖酶、或其组合。
26、进一步地，所述核酸构建物还包括启动子、终止子、增强子元件、kozak序列、ω序列、3-utr或其组合。
27、在一种可行的方案中，所述启动子选自下组之一：t7启动子、t3启动子、sp6启动子、或其组合。更优选地，所述启动子为t7启动子。
28、在另一种可行的方案中，所述终止子选自下组之一：t7终止子、t3终止子、sp6终止子、或其组合。
29、在另一种可行的方案中，所述终止子序列选自下组之一：
30、(a)编码如seq id no.300～seq id no.304中任意一项所示的多核苷本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种增强无细胞体系蛋白质表达的信号肽，其特征在于：所述的信号肽的的氨基酸序列选自下组之一：
2.如权利要求1所述信号肽，其特征在于：所述信号肽的编码序列来源选自下组中的一种或多种细胞：原核细胞、真核细胞；另一优选例中，所述信号肽来源选自下组选自下组中的一种或多种细胞：人(human)、中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO)、昆虫细胞(insect)、麦胚(Wheatgerm cells)、兔网织红细胞(Rabbit reticulocyte)、酵母细胞。
3.一种权利要求1-2任一项所述信号肽的编码序列，其特征在于，所述的信号肽的编码序列选自下组之一；
4.如权利要求1或2所述的信号肽、或3所述的信号肽的编码序列，其特征在于，所述外源蛋白的编码序列来自哺乳动物，较佳地灵长动物，啮齿动物，包括人、小鼠、大鼠；优选地，所述外源蛋白选自可溶性蛋白、功能性蛋白以及活性蛋白的天然蛋白或突变蛋白或人工设计蛋白；更优选地，所述的外源蛋白的编码序列选自下组：编码荧光素蛋白，或荧光素酶(如萤火虫荧光素酶)、绿色荧光蛋
5.一种核酸构建物，其特征在于，包括如权利要求3或4所述的信号肽编码序列和外源蛋白编码序列，且所述的信号肽编码序列与外源蛋白的编码序列的N端相连接。
6.如权利要求5所述的核酸构建物，其特征在于，所述的信号肽编码序列与外源蛋白的编码序列的N端相通过键或者连接序列连接；优选地，所述连接序列为密码子优化的连接序列；更有优选地，所述连接序列具有不易形成二级结构的序列(如AT-rich序列，无发卡结构，无G-quadruplex等等)，不富含稀有密码子。
7.如权利要求5-6任一项所述的核酸构建物，其特征在于，所述外源蛋白的编码序列来自原核生物、真核生物；优选的，所述外源蛋白的编码序列来自动物、植物、病原体；更优选的，所述外源蛋白的编码序列来自哺乳动物，较佳地灵长动物，啮齿动物，包括人、小鼠、大鼠；优选地，所述外源蛋白选自下组之一：荧光素蛋白，或荧光素酶(如萤火虫荧光素酶)、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、氨酰tRNA合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、过氧化氢酶、肌动蛋白、抗体的可变区域、荧光素酶突变、α-淀粉酶、肠道菌素A、丙型肝炎病毒E2糖蛋白、胰岛素前体、干扰素αA、白细胞介素-1β、溶菌酶素、血清白蛋白、单链抗体段(scFV)、甲状腺素运载蛋白、酪氨酸酶、木聚糖酶、或其组合。
8.如权利要求7所述的核酸构建物，其特征在于：所述核酸构建物还包括启动子、终止子、增强子元件、kozak序列、Ω序列以及3-UTR中的任意一种或多种。
9.一种载体或载体组合，所述的载体或载体组合含有如权利要求3或4所述的信号肽编码序列或如权利要求5-8任一项的核酸构建物。
10.一种基因工程细胞，所述基因工程细胞的基因组的一个或多个位点整合有如权利要求3或4所述的信号肽编码序列或如权利要求5-8任一项的核酸构建物，或者所述基因工程细胞中含有权利要求9所述的载体或载体组合；优选地，所述基因工程细胞包括原核细胞、真核细胞。
11.一种体外蛋白合成体系，其特征在于，包含权利要求5-8任一项所述的核酸构建物、权利要求9所述的载体或载体组合或由权利要求10所述的基因工程细胞制备的细胞提取物。
12.根据权利要求如权利要求1或2所述的信号肽、3或4所述的信号肽编码序列或如权利要求5-8任一项的核酸构建物、权利要求9所述的载体或载体组合、权利要求10所述的基因工程细胞或权利要求11所述试剂盒在体外蛋白合成蛋白中的应用。
13.一种体外无细胞合成蛋白的方法，其特征在于，所述体外高通量的外源蛋白合成方法包括步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种增强无细胞体系蛋白质表达的信号肽，其特征在于：所述的信号肽的的氨基酸序列选自下组之一：
2.如权利要求1所述信号肽，其特征在于：所述信号肽的编码序列来源选自下组中的一种或多种细胞：原核细胞、真核细胞；另一优选例中，所述信号肽来源选自下组选自下组中的一种或多种细胞：人(human)、中国仓鼠卵巢细胞(chinese hamster ovary cell,cho)、昆虫细胞(insect)、麦胚(wheatgerm cells)、兔网织红细胞(rabbit reticulocyte)、酵母细胞。
3.一种权利要求1-2任一项所述信号肽的编码序列，其特征在于，所述的信号肽的编码序列选自下组之一；
4.如权利要求1或2所述的信号肽、或3所述的信号肽的编码序列，其特征在于，所述外源蛋白的编码序列来自哺乳动物，较佳地灵长动物，啮齿动物，包括人、小鼠、大鼠；优选地，所述外源蛋白选自可溶性蛋白、功能性蛋白以及活性蛋白的天然蛋白或突变蛋白或人工设计蛋白；更优选地，所述的外源蛋白的编码序列选自下组：编码荧光素蛋白，或荧光素酶(如萤火虫荧光素酶)、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、氨酰trna合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、过氧化氢酶、肌动蛋白、抗体的可变区域的外源dna、荧光素酶突变体的dna或其组合；更优选地，所述外源蛋白选自下组：荧光素蛋白，或荧光素酶(如萤火虫荧光素酶)、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、氨酰trna合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、过氧化氢酶、肌动蛋白、抗体的可变区域、荧光素酶突变、α-淀粉酶、肠道菌素a、丙型肝炎病毒e2糖蛋白、胰岛素前体、干扰素αa、白细胞介素-1β、溶菌酶素、血清白蛋白、单链抗体段(scfv)、甲状腺素运载蛋白、酪氨酸酶、木聚糖酶、或其组合。
5.一种核酸构建物，其特征在于，包括如权利要求3或4所述的信号肽编码序列和外源蛋白编码序列，且所述的信号肽编码序列与外源蛋白的编码序列的n端相连接。
6.如权利要求5所述的核酸构建物，其特征在于，所述的信号肽编码序列与外源蛋白的编码序列的n端相通过键或者连接序列连接；优选地，所述连接序列为密码子优化的连接序列；更有优...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭敏，杨隆金，胡家保，徐丽琼，于雪，
申请(专利权)人：康码上海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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