【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体地，涉及一种增强无细胞表达蛋白的dna元件及其应用及其在d2p中应用。
技术介绍
1、蛋白质是一切生命的物质基础，是机体细胞的重要组成部分。蛋白质在生物、医药领域拥有重要的应用和巨大的价值，比如分子酶(taq酶、pfu酶)、抗体、激素、血红蛋白、胶原蛋白、甜蛋白等等都是蛋白质，这些蛋白质在科研、医药、大健康、美容、食品等领域具有无限的商业价值。蛋白质有如此巨大的应用和前景，如何能够以更低成本大量制备这些蛋白质是一项迫在眉睫的技术问题。传统的方法一般通过大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞进行表达纯化。在应用医药和食品等领域，大肠杆菌面临去内毒素的问题。而酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞生产周期相对较长、成本较高。
2、除了以上人们对于细胞内蛋白质合成的了解之外，蛋白质合成也可以在细胞外进行。蛋白质体外合成系统一般是指在细菌、真菌、植物细胞或动物细胞的裂解体系中，加入mrna或者dna模板、rna聚合酶及氨基酸和atp等组分，完成外源蛋白的快速高效翻译。
3、在体外合成蛋白的过程中，mrna的结构对蛋白表达量影响特别巨大，例如、3-utr序列结构。然而很多这些序列结构的研究局限于细胞合成蛋白质领域，细胞合成和无细胞合成拥有巨大的差异。这样导致在细胞合成中有效的序列用于无细胞体系合成却不一定有效。因此，本领域迫切需要开发一种基因改造的mrna，使得能够增强蛋白表达，从而进一步降低蛋白合成成本。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于
2、本专利技术的目的在于提供一种在真核细胞中能够用于蛋白质表达和纯化的核酸构建物，将该核酸构建物应用于体外蛋白质表达系统中，可以提高外源蛋白的表达效率，降低成本。
3、本专利技术第一方面提供了一种核酸构建物，所述核酸构建物具有从5’至3’的式i结构：
4、z1-z2(i)
5、式中，
6、z1、z2分别为用于构成所述构建物的元件；
7、各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；
8、z1为无或外源蛋白的编码序列；
9、z2为无或3’端非翻译区(3-utr)的核酸序列，
10、所述z2和z1为野生型序列的改造序列；
11、所述核酸构建物能够增强无细胞表达蛋白。
12、所述“增强”是指将无细胞表达蛋白的效率和/或产量提高至少5％以上，优选10％以上，更优选30以上，最优选100％以上。
13、进一步地，所述“-”所示的连接序列为密码子优化的连接序列。
14、在另一优选例中，所述连接序列具有不易形成二级结构的序列(如at-rich序列，无发卡结构，无g-quadruplex等等)，不富含稀有密码子。
15、在另一优选例中，所述连接序列可带有酶切位点。
16、进一步地，所述z1所示的外源蛋白的编码序列来自原核生物、真核生物。
17、在另一优选例中，所述外源蛋白的编码序列来自动物、植物、病原体。
18、在另一优选例中，所述外源蛋白的编码序列来自哺乳动物，较佳地灵长动物，啮齿动物，包括人、小鼠、大鼠。
19、在另一优选例中，所述外源蛋白选自可溶性蛋白、功能性蛋白以及活性蛋白的天然蛋白或突变蛋白或人工设计蛋白。
20、在另一优选例中，所述的外源蛋白的编码序列选自下组：编码荧光素蛋白，或荧光素酶(如萤火虫荧光素酶)、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、氨酰trna合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、过氧化氢酶、肌动蛋白、抗体的可变区域的外源dna、荧光素酶突变体的dna或其组合。
21、在另一优选例中，所述外源蛋白选自下组：荧光素蛋白，或荧光素酶(如萤火虫荧光素酶)、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、氨酰trna合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、过氧化氢酶、肌动蛋白、抗体的可变区域、荧光素酶突变、α-淀粉酶、肠道菌素a、丙型肝炎病毒e2糖蛋白、胰岛素前体、干扰素αa、白细胞介素-1β、溶菌酶素、血清白蛋白、单链抗体段(scfv)、甲状腺素运载蛋白、酪氨酸酶、木聚糖酶、或其组合。
22、另一优选例中，所述z2所示的3’端非翻译区(3-utr)的编码序列选自下组之一；
23、(a)如seq id no.145～seq id no.171中任意一项所示的多核苷酸；
24、(b)核苷酸序列与seq id no.145～seq id no.171中任意一项所示序列的同源性≥30％，较佳地，75％(较佳地≥85％，更佳地≥90％或≥95％或≥98％或≥99％)的多核苷酸；
25、(c)在seq id no.145～seq id no.171中任意一项所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短或添加1-20个，更佳地1-10个核苷酸的多核苷酸；
26、(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
27、在一优选例子中，所述核酸构建物具有从5’至3’的式i结构：
28、z3-z1-z2(i)
29、式中，
30、z3、z1、z2分别为用于构成所述构建物的元件；
31、各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；
32、z3为信号肽的编码序列；
33、z1为无或外源蛋白的编码序列；
34、z2为3’端非翻译区(3-utr)的核酸序列，
35、所述z3和z2为野生型序列的改造序列；
36、所述核酸构建物能够增强无细胞表达蛋白。
37、所述z3为信号肽的编码序列来源选自下组选自下组之一的一种或多种细胞：原核细胞、真核细胞。另一优选例中，所述信号肽来源选自下组选自下组之一的一种或多种细胞：人(human)、中国仓鼠卵巢细胞(chinese hamster ovary cell,cho)、昆虫细胞(insect)、麦胚(wheatgerm cells)、兔网织红细胞(rabbit reticulocyte)、酵母细胞。
38、所述核酸构建物还包括信号肽的编码序列，所述的信号肽的的氨基酸序列选自下组之一：
39、如seq id no.1～seq id no.72所示的氨基酸序列；
40、另一优选例中，所述的信号肽的编码序列选自下组之一；
41、(a)seq id no.73～seq id no.144中任意一项所示的多核苷酸；
42、(b)核苷酸序列与seq id no.73～seq id no.144中任意一项所示序列的同源性≥30％，较佳地，75％(较佳地≥85％，更佳地≥90％或≥95％或≥98％或≥99％)的多核苷酸；
43、(c)在seq id no.73～seq id no.144中任意一项所示多核苷酸的5'端和/或本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种核酸构建物，所述核酸构建物具有从5’至3’的式I结构：
2.如权利要求3所述的核酸构建物，其特征在于，所述“-”所示的连接序列为密码子优化的连接序列；优选地，所述连接序列具有不易形成二级结构的序列(如AT-rich序列，无发卡结构，无G-quadruplex等等)，不富含稀有密码子。
3.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述Z1所示的外源蛋白的编码序列来自原核生物、真核生物；优选的，所述外源蛋白的编码序列来自动物、植物、病原体；更优选的，所述外源蛋白的编码序列来自哺乳动物，较佳地灵长动物，啮齿动物，包括人、小鼠、大鼠；优选地，所述外源蛋白选自可溶性蛋白、功能性蛋白以及活性蛋白的天然蛋白或突变蛋白或人工设计蛋白；更优选地，所述外源蛋白选自下组之一：荧光素蛋白，或荧光素酶(如萤火虫荧光素酶)、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、氨酰tRNA合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、过氧化氢酶、肌动蛋白、抗体的可变区域、荧光素酶突变、α-淀粉酶、肠道菌素A、丙型肝炎病毒E2糖蛋白、胰岛素前体、干扰素αA、白细胞介素-1β、溶菌酶素、血清白蛋白、单链抗体段(scF
4.如权利要求1-3任意一项所述的核酸构建物，其特征在于：所述Z2所示的3’端非翻译区(3-UTR)的编码序选自下组之一；
5.如权利要求1-4任意一项所述的核酸构建物，其特征在于：所述核酸构建物还包括信号肽的编码序列，所述的信号肽的的氨基酸序列选自下组之一：
6.如权利要求5所述的核酸构建物，其特征在于：所述的信号肽的编码序列选自下组之一；
7.如权利要求1-6任意一项所述的核酸构建物，其特征在于：所述核酸构建物还包括增强子元件、kozak序列、Ω序列、或其组合。
8.如权利要求1-7任意一项所述的核酸构建物，其特征在于：所述IRES元件来源选自下组之一的一种或多种细胞：人体(human)细胞、中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovarycell,CHO)、昆虫细胞(insect)、麦胚(Wheatgerm cells)、兔网织红细胞(Rabbitreticulocyte)；优选地，
9.如权利要求7或8核酸构建物，其特征在于：所述kozak序列选自下组之一：
10.如权利要求7-9任意一项所述的核酸构建物，其特征在于：所述Ω序列选自下组之一：所述Ω序列选自下组之一；
11.如权利要求7-10任意一项所述的核酸构建物，其特征在于：所述IRES元件、kozak序列和Ω序列组合构成5’端非翻译区(5-UTR)；
12.一种载体或载体组合，所述的载体或载体组合含有权利要求1-11任一项的核酸构建物。
13.一种基因工程细胞，所述基因工程细胞的基因组的一个或多个位点整合有权利要求1-11任一项所述的核酸构建物，或者所述基因工程细胞中含有权利要求12所述的载体或载体组合；优选地，所述基因工程细胞包括原核细胞、真核细胞，更优选地，所述基因工程细胞为酵母细胞。
14.一种体外蛋白合成体系，其特征在于，包含权利要求1-11任一项所述的核酸构建物、权利要求12所述的载体或载体组合或由权利要求13所述的基因工程细胞制备的细胞提取物。
15.根据权利要求1-11任一项所述的核酸构建物、权利要求12所述的载体或载体组合、权利要求13所述的基因工程细胞或权利要求14所述试剂盒在体外蛋白合成蛋白中的应用。
16.一种体外无细胞合成蛋白的方法，其特征在于，所述体外高通量的外源蛋白合成方法包括步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种核酸构建物，所述核酸构建物具有从5’至3’的式i结构：
2.如权利要求3所述的核酸构建物，其特征在于，所述“-”所示的连接序列为密码子优化的连接序列；优选地，所述连接序列具有不易形成二级结构的序列(如at-rich序列，无发卡结构，无g-quadruplex等等)，不富含稀有密码子。
3.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述z1所示的外源蛋白的编码序列来自原核生物、真核生物；优选的，所述外源蛋白的编码序列来自动物、植物、病原体；更优选的，所述外源蛋白的编码序列来自哺乳动物，较佳地灵长动物，啮齿动物，包括人、小鼠、大鼠；优选地，所述外源蛋白选自可溶性蛋白、功能性蛋白以及活性蛋白的天然蛋白或突变蛋白或人工设计蛋白；更优选地，所述外源蛋白选自下组之一：荧光素蛋白，或荧光素酶(如萤火虫荧光素酶)、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、氨酰trna合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、过氧化氢酶、肌动蛋白、抗体的可变区域、荧光素酶突变、α-淀粉酶、肠道菌素a、丙型肝炎病毒e2糖蛋白、胰岛素前体、干扰素αa、白细胞介素-1β、溶菌酶素、血清白蛋白、单链抗体段(scfv)、甲状腺素运载蛋白、酪氨酸酶、木聚糖酶、或其组合。
4.如权利要求1-3任意一项所述的核酸构建物，其特征在于：所述z2所示的3’端非翻译区(3-utr)的编码序选自下组之一；
5.如权利要求1-4任意一项所述的核酸构建物，其特征在于：所述核酸构建物还包括信号肽的编码序列，所述的信号肽的的氨基酸序列选自下组之一：
6.如权利要求5所述的核酸构建物，其特征在于：所述的信号肽的编码序列选自下组之一；
7.如权利要求1-6任意一项所述的核酸构建物，其特征在于：所述核酸构建物还包括增强子元件、kozak序列、ω序列、或其...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭敏，杨隆金，胡家保，徐丽琼，于雪，
申请(专利权)人：康码上海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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