【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及蛋白质检测，尤其是涉及一种基于阵列式纳米孔结构的蛋白质检测方法。
技术介绍
1、现代蛋白质组学在很大程度上依赖于串联质谱（ms）技术，因其高精度和在复杂混合物中识别及定量蛋白质的能力而受到重视。然而，大多数质谱分析器体积庞大，投资成本高，维护费用昂贵，且需要专业人员操作。随着人们对高通量蛋白质组学研究和个性化医疗不断增长的需求，亟需开发可扩展且低成本的蛋白质分析技术。
2、与质谱设备相比，基于纳米孔的检测技术提供了一个低成本和高通量的平台，并且能够适应原生环境。在纳米孔分析中，当分析物通过单个纳米孔时，在施加电位的作用下，会阻断通过纳米孔的离子电流。重要的是，电流阻断的大小主要与分析物排除的体积成正比，这允许对化学性质相似的（生物）聚合物如peg链、dna、蛋白质和肽段进行尺寸区分。此外，纳米孔能够准确检测包括蛋白质和dna在内的各种分子，并且具备无标记、快速、单分子水平高精度的优势。
3、目前生物纳米孔检测技术已被证实可以实现20种氨基酸的高灵敏的检测分辨，最近，martin-baniandres等人[1]使用一种工程化的带电选择性纳米孔，利用电渗现象来实现单个肽链的非酶捕获、展开和转运，实现肽链内部翻译后修饰的检测，这些肽链的长度可以超过1200个氨基酸残基，为纳米孔实现长读长蛋白质测序提供一个可能。 nova等人[2]利用hel308 解旋酶控制肽链通过纳米孔的传感区域，实现了对单个分子水平上的磷酸化修饰的检测，并能以95%的准确率区分具有一个或两个紧密磷酸化位点的肽序列，但由于纳米孔
4、因此，提出一种基于阵列式组合纳米孔结构的蛋白质测序方法。首先，在一块芯片膜上加工阵列凹槽，并在每个凹槽底部位置都固定一个对dna链具有合成或者解旋功能的蛋白；继而在凹槽顶部铺上一层磷脂双分子层，将对蛋白质和dna分子具有高分辨率读取能力的蛋白嵌入凹槽上层的磷脂双分子层中；当肽链修饰的dna分子通过嵌入磷脂双分子层中的读取蛋白进入凹槽中并与凹槽底部的功能蛋白结合时，固定在凹槽底部的功能蛋白开始对dna分子进行合成或者解旋，驱动dna分子上经肽链修饰部分通过嵌入磷脂双分子层中的读取蛋白，产生不同的阻塞电流幅值，完成对修饰在dna分子上的肽链读取。两种功能蛋白之间的相对距离是影响修饰在dna分子上肽链读长的关键因素，本方法中两种功能蛋白之间的相对距离可以通过对芯片膜厚和凹槽的加工深度进行控制，有效解决了肽链因纳米空间限制而导致的读长短的难题。同时，这种阵列式的组合蛋白传感器还可以实现对肽链的高通量检测。
5、[1]martin-baniandres, p., lan, wh., board, s. et al. enzyme-lessnanopore detection of post-translational modifications within longpolypeptides. nat. nanotechnol. 18, 1335–1340 (2023).
6、[2]nova, i.c., ritmejeris, j., brinkerhoff, h. et al. detection ofphosphorylation post-translational modifications along single peptides withnanopores. nat biotechnol 42, 710–714 (2024).
7、[3]motone, k., kontogiorgos-heintz, d., wee, j. et al. multi-pass,single-molecule nanopore reading of long protein strands. nature 633, 662–669(2024).
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种基于阵列式纳米孔结构的蛋白质检测方法，纳米孔结构中两种功能蛋白之间的相对距离可以通过对芯片膜厚和凹槽的加工深度进行调节，有效解决了肽链因纳米空间限制而导致的读长短的难题；同时阵列式的组合蛋白传感器还可以实现对肽链的高通量检测，实现稳定的、长读长、高准确的蛋白测序。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了一种基于阵列式纳米孔结构的蛋白质检测方法，包括以下步骤：
3、1）构建阵列式纳米孔结构：
4、步骤1，芯片薄膜进行阵列凹槽加工：在芯片薄膜上加工有一定间距和深度的阵列凹槽；
5、步骤2，芯片薄膜底部连接温度控制元件：将温度控制元件与芯片薄膜底部进行连接；
6、步骤3，将蛋白固定在阵列凹槽底部：将对dna链具有合成及解旋功能的蛋白固定在每个阵列凹槽的底部；
7、步骤4，芯片薄膜表面覆盖磷脂层：将磷脂双分子层涂抹在芯片薄膜表面，在阵列凹槽的表面形成一层磷脂双分子层；
8、步骤5，电驱动嵌入功能蛋白：将对蛋白质和dna分子具有高分辨率读取能力的蛋白嵌入阵列凹槽表面的磷脂双分子层，得到阵列式纳米孔结构；
9、2）进行蛋白质检测：
10、步骤6，经肽链修饰的dna在电场力驱动下通过镶嵌在磷脂双分子层上的功能蛋白，产生阻塞电流信号；此时启动温度控制元件，使其对电解质溶液进行升温，直至达到阵列凹槽底部蛋白的正常工作温度；当经肽链修饰的dna运动到与阵列凹槽底部的蛋白结合时，阵列凹槽底部蛋白以单链dna分子为模板，合成或解开双链dna的过程中，驱动修饰在dna链上的肽链通过具有高分辨率读取能力的蛋白，实现对肽链的信息读取。
11、进一步地，步骤1中阵列凹槽为矩形阵列或环形阵列，阵列的间距为100nm-100μm，阵列凹槽的深度为100nm-1mm。
12、进一步地，步骤2中温度控制元件包括帕尔贴元件。
13、进一步地，步骤3中对dna链具有合成及解旋功能的蛋白包括dna合成酶，dna解旋酶、dna拓扑异构酶等。
14、进一步地，步骤5中对蛋白质和dna分子具有高分辨率读取能力的蛋白包括mspa、sp1、α-hl、aerolysin、phi29、csgg、spp1、frac。
15、本专利技术的检测原理为：
16、经肽链修饰的dna在电场力驱动下通过镶嵌在磷脂双分子层上的功能蛋白，产生阻塞电流信号；此时启动温度控制元件，使其对电解质溶液进行升温，直至达到阵列凹槽底部蛋白的正常工作温度；当经肽链修饰的dna运本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于阵列式纳米孔结构的蛋白质检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种基于阵列式纳米孔结构的蛋白质检测方法，其特征在于：步骤1中阵列凹槽为矩形阵列或环形阵列、阵列的间距为100nm-100μm，阵列凹槽的深度为100nm-1mm。
3.根据权利要求1所述的一种基于阵列式纳米孔结构的蛋白质检测方法，其特征在于：步骤2中温度控制元件包括帕尔贴元件。
4.根据权利要求1所述的一种基于阵列式纳米孔结构的蛋白质检测方法，其特征在于：步骤3中对DNA链具有合成及解旋功能的蛋白包括DNA合成酶、DNA解旋酶或DNA拓扑异构酶。
5.根据权利要求1所述的一种基于阵列式纳米孔结构的蛋白质检测方法，其特征在于：步骤5中对蛋白质和DNA分子具有高分辨率读取能力的蛋白包括MspA、SP1、α-HL、aerolysin、Phi29、CsgG、SPP1或FraC。
【技术特征摘要】
1.一种基于阵列式纳米孔结构的蛋白质检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种基于阵列式纳米孔结构的蛋白质检测方法，其特征在于：步骤1中阵列凹槽为矩形阵列或环形阵列、阵列的间距为100nm-100μm，阵列凹槽的深度为100nm-1mm。
3.根据权利要求1所述的一种基于阵列式纳米孔结构的蛋白质检测方法，其特征在于：步骤2中温度控制元件包括帕尔贴元件。
【专利技术属性】
技术研发人员：吴宏文，袁志山，许德荣，
申请(专利权)人：江西省转化医学研究院，
类型：发明
国别省市：
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