【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及毒素检测，尤其涉及一种基于lc-ms/ms的相思子毒素活性的检测方法。
技术介绍
1、相思子毒素(abrin toxin，at)是一种来源于豆科藤本植物相思子的植物毒素，分子量约为60-65kda，等电点在6-8之间，是由一条具有n-糖苷酶活性a链和一条具有半乳糖特异性的b链组成，它们通过二硫键连接在一起，b链介导a链进入细胞，a链发挥n-糖苷酶活性，特异性的切割核糖体28rrna第4324的位点上的腺嘌呤，导致蛋白质失活，从而发挥毒性作用。at分为a、b、c、d四个亚型，其中a亚型的细胞毒性最强且含量最高。at可通过不同的感染途径进入人体引起中毒，包括呼吸道、消化道、肌肉注射等。目前有许多特定的检测方法来检测这种有毒植物蛋白，但很少基于毒素活性的检测。因此探究得到一种可以实现快速、准确的检测at活性的方法具有重要意义，这对于识别生物活性毒素也至关重要。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种基于lc-ms/ms的相思子毒素活性的检测方法，通过检测反应脱落腺嘌呤峰面积来进行样本定性的基础上，进一步通过lc-ms/ms建立的标准曲线测定相思子毒素的浓度，来达到检测相思子毒素的目的，该检测方案反应组分简单，反应时间相对较短，在复杂基质样品的分析中更具优势，检测效果更好，灵敏度更高、特异性更强。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术提供了一种基于lc-ms/ms的相思子毒素活性的检测方法，其特征在于，包括
4、(1)将系列梯度稀释的相思子毒素标准品分别与反应体系a混合进行反应，利用lc-ms/ms进行检测，然后以相思子毒素的浓度为横坐标，(阳性样本脱落的腺嘌呤峰面积与内标阿昔洛韦相应的峰面积比值):(阴性样本脱落的腺嘌呤峰面积与内标阿昔洛韦相应的峰面积比值)为纵坐标建立标准曲线；
5、(2)将待测样本与反应体系a混合进行反应，利用lc-ms/ms进行检测，根据脱落腺嘌呤峰面积对样本定性，若待测样本为阳性样本，并将(阳性样本脱落的腺嘌呤峰面积与内标阿昔洛韦相应的峰面积比值):(阴性样本脱落的腺嘌呤峰面积与内标阿昔洛韦相应的峰面积比值)代入步骤(1)所述标准曲线计算得到相思子毒素的浓度；当待测样本的脱落腺嘌呤峰面积与阴性对照组脱落腺嘌呤峰面积的比值大于5，则表明为阳性样本。
6、作为优选，所述反应体系a包括柠檬酸铵+mg2++edta缓冲液、bsa溶液、寡核苷酸链底物以及内标阿昔洛韦溶液。
7、作为优选，所述lc-ms/ms的液相色谱条件为：色谱柱为waters -c18反相柱，内径×长度为2.1mm×150mm，粒径为3.5μm；流动相为10mm甲酸铵，ph＝4；有机相为100％甲醇；流速为0.2ml/min；进样量为2μl。
8、作为优选，所述lc-ms/ms的mrm模式参数为：腺嘌呤m/z 136→m/z 92，m/z 136→m/z 119；阿昔洛韦m/z 226.1→m/z 134.9，m/z 226.1→m/z 152.05。
9、作为优选，步骤(2)所述反应的时间为1.5-2.2h，所述反应的温度为42-46℃。
10、作为优选，步骤(2)所述柠檬酸铵+mg2++edta缓冲液的ph为4.0-4.1，柠檬酸铵+mg2++edta缓冲液中柠檬酸铵的终浓度为0.1-10mm，柠檬酸铵+mg2++edta缓冲液中mg2+的终浓度为0.1-5mm，柠檬酸铵+mg2++edta缓冲液中edta的终浓度为0.1-10mm；
11、所述bsa溶液的终浓度为8-12μg/ml；
12、所述寡核苷酸链底物的终浓度为0.1-0.3μm；
13、所述内标阿昔洛韦溶液的终浓度为8-12ng/ml。
14、作为优选，步骤(2)所述寡核苷酸链底物的序列如seq id no.11所示。
15、作为优选，步骤(2)所述阴性对照组测定的是无菌水。
16、通过采用上述技术方案，本专利技术具有如下有益效果：
17、本专利技术技术方案利用相思子毒素的n-糖苷酶活性能特异性的切割核糖体上的腺嘌呤而建立的检测方法，反应原理是at发挥n-糖苷酶活性，使底物脱落腺嘌呤，通过检测反应脱落腺嘌呤峰面积来进行样本定性的基础上，进一步通过lc-ms/ms建立的标准曲线测定相思子毒素的浓度，达到检测毒素的目的。该检测方案反应组分简单，反应时间相对较短，在复杂基质样品的分析中更具优势，检测效果更好，灵敏度更高、特异性更强。
18、本专利技术中实验也表明了最优反应体系为ph为4.05的柠檬酸铵+mg2++edta缓冲液、终浓度为10μg/ml的bsa溶液、终浓度为0.2μm的直链单链dna20a底物、终浓度为10ng/ml的内标阿昔洛韦溶液；最佳反应温度为45℃，最佳反应时间为2h。采用本专利技术检测方法结合上述最优反应参数，测得使用包被抗体的磁珠进行富集后的相思子毒素样本，检测灵敏度可达到0.391ng/ml。
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1.一种基于LC-MS/MS的相思子毒素活性的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述LC-MS/MS的液相色谱条件为：色谱柱为Waters-C18反相柱，内径×长度为2.1mm×150mm，粒径为3.5μm；流动相为10mM甲酸铵，pH＝4；有机相为100％甲醇；流速为0.2mL/min；进样量为2μL。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述LC-MS/MS的MRM模式参数为：腺嘌呤m/z 136→m/z 92，m/z 136→m/z 119；阿昔洛韦m/z 226.1→m/z 134.9，m/z226.1→m/z152.05。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)所述反应的时间为1.5-2.2h，所述反应的温度为42-46℃。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)所述柠檬酸铵+Mg2++EDTA缓冲液的pH为4.0-4.1，柠檬酸铵+Mg2++EDTA缓冲液中柠檬酸铵的终浓度为0.1-10mM，柠檬酸铵+Mg2++EDTA缓冲液
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)所述寡核苷酸链底物的序列如SEQ ID NO.11所示。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)所述阴性对照组测定的是无菌水。
...【技术特征摘要】
1.一种基于lc-ms/ms的相思子毒素活性的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述lc-ms/ms的液相色谱条件为：色谱柱为waters-c18反相柱，内径×长度为2.1mm×150mm，粒径为3.5μm；流动相为10mm甲酸铵，ph＝4；有机相为100％甲醇；流速为0.2ml/min；进样量为2μl。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述lc-ms/ms的mrm模式参数为：腺嘌呤m/z 136→m/z 92，m/z 136→m/z 119；阿昔洛韦m/z 226.1→m/z 134.9，m/z226.1→m/z152.05。
4.根据权利要求1所述的检测...
【专利技术属性】
技术研发人员：辛文文，李佳欣，康琳，董理娜，柳婷婷，高姗，王菁，王景林，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：
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