【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于核酸检测，具体涉及一种crispr-gs12系统介导的多重核酸检测技术及其应用。
技术介绍
1、有规律间隔短回文重复序列簇(crispr)和crispr相关蛋白(crispr/cas)被认为是下一代分子诊断工具。它是细菌和古细菌的一种适应性免疫系统，而后来报道的omegarna可编程系统可能是crispr/cas的祖先。最近的研究还描述了fanzor核酸酶，它可能属于真核生物编辑系统，是细菌感染真核生物的进化产物。上述情况表明，在生物进化过程中，cas核酸酶的宿主、组成、结构和功能的高度进化导致了核酸靶标、序列偏好和结合活性的差异。由于v型cas12a家族和vi型cas13a家族具有独特的切割活性和出色的兼容性，由与靶序列互补的单个crispr rna(crrna)引导，无需单独的反式激活crrna(tracrna)，crispr/cas系统在核酸诊断中发挥着重要作用。
2、目前，病原体的感染和传播仍然是公共卫生的主要威胁之一。在病原体核酸诊断中，对受感染个体的单个病毒核酸检测不足以在病毒感染的早期阶段进行准确诊断，尤其是在养猪场等农业环境中，由于免疫缺陷，多种病毒容易同时感染。此外，对同一感染个体进行多种不同标记物的检测既麻烦又耗时。因此，有必要开发多重核酸检测技术，以准确、经济、高效的方式同时检测多种核酸，并行多重检测是诊断方法和设备发展的趋势。利用与生物传感设备和分子元件相耦合的cas效应器，已经开发出了许多高灵敏度、可并行的多重检测方法，这些方法需要具有多学科背景的操作人员和大多局限于实验室环境
3、本专利技术提出了一种基于crispr/cas12a家族同源核酸酶实现多重核酸检测的方法。首先，我们从新发现的cas12a同源核酸酶中筛选到4种核酸酶gs12-1、gs12-4、gs12-9和gs12-18。比较发现它们针对ssdna-fq报告基因具有特异碱基偏好性。此外，通过截断、添加或修改crrna的二级结构，以及通过改变crrna中的scaffold序列组成，鉴定到能提高gs12核酸酶反式切割特异性的最佳crrna变体。进一步筛选和确定了三种无干扰的荧光修饰基团，并通过结合多重rpa扩增实现了对塞内卡病毒(sva)、猪瘟病毒(csfv)和非洲猪瘟病毒(asfv)三种病毒核酸的高灵敏度和特异性荧光检测，以及对sva、asfv两种病毒核酸的裸眼可视化检测。
4、总之，本专利技术拓展了cas12a家族核酸酶的应用范围，并首次利用cas12家族核酸酶成员实现了多重核酸检测，为基于crispr系统介导的多重核酸检测技术开发提供了新手段。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种crispr/gs12系统介导的多重核酸检测技术及应用。
2、本专利技术的第一方面，提供了一种基于crispr/gs12系统介导的多重核酸检测试剂盒。
3、一种基于crispr/gs12系统介导的多重核酸检测试剂盒，包括：
4、(1)gs12核酸酶，所述gs12核酸酶包括gs12-1、gs12-4、gs12-9及gs12-18核酸酶中的至少两种，所述gs12-1的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述gs12-4的氨基酸序列如seq id no.4所示，所述gs12-9的氨基酸序列如seq id no.9所示，所述gs12-18的氨基酸序列如seq id no.18所示；
5、(2)与所述gs12核酸酶特异对应的报告基因，gs12-1核酸酶对应的报告基因序列为5′-aaaaa-3′，gs12-4核酸酶对应的报告基因序列为5′-ttttt-3′，gs12-9核酸酶对应的报告基因序列为5′-tatat-3′，gs12-18核酸酶对应的报告基因序列为5′-ttatt-3′，且所述报告基因5′端修饰激发波长互不干扰的荧光基团，3′端修饰猝灭基团；
6、(3)与所述gs12核酸酶相对应的crna，所述crna含有scaffold和靶向序列；优选地，所述gs12-1核酸酶的crrna中scaffold序列如seq id no.22所示，所述gs12-4核酸酶的crrna中scaffold的序列如seq id no.23所示，所述gs12-9核酸酶的crrna中scaffold的序列如seq id no.24所示，所述gs12-18核酸酶的crrna中scaffold的序列如seq id no.25所示。
7、本专利技术的第二方面，提供了基于crispr/gs12系统介导的塞内卡病毒、猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒多重核酸检测试剂盒。
8、基于crispr/gs12系统介导的多重检测塞内卡病毒、猪瘟病毒以及非洲猪瘟病毒的试剂盒，包括：
9、(1)gs12核酸酶，所述gs12核酸酶选自gs12-1、gs12-4、gs12-9及gs12-18核酸酶中的任意3种，所述gs12-1的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述gs12-4的氨基酸序列如seqid no.4所示，所述gs12-9的氨基酸序列如seq id no.9所示，所述gs12-18的氨基酸序列如seq id no.18所示；优选地，所述gs12核酸酶为gs12-1、gs12-4及gs12-18这3种核酸酶；
10、(2)与所述gs12核酸酶特异对应的报告基因，gs12-1蛋白对应的报告基因序列为5′-aaaaa-3′，gs12-4蛋白对应的报告基因序列为5′-ttttt-3′，gs12-9蛋白对应的报告基因序列为5′-tatat-3′，gs12-18蛋白对应的报告基因序列为5′-ttatt-3′，且所述报告基因5′端修饰激发波长互不干扰的荧光基团，3′端修饰猝灭基团；
11、(3)特异靶向塞内卡病毒vp1基因、猪瘟病毒e2基因以及非洲猪瘟病毒p72基因的crna，所述靶向塞内卡病毒vp1基因的crna序列如seq id no.26所示，所述靶向猪瘟病毒e2基因的crna序列如seq id no.27所示，所述靶向非洲猪瘟病毒p72基因的crna序列如seqid no.28所示。
12、进一步地，所述试剂盒还包括用于扩增塞内卡病毒vp1基因、猪瘟病毒e2基因以及非洲猪瘟病毒p72基因的引物，优选地，所述用于扩增塞内卡病毒vp1基因的rpa引物序列如seq id no.29和30所示，所述用于扩增猪瘟病毒e2基因的rpa引物序列如seq id no.31和32所示，所述用于扩增非洲猪瘟病毒p72基因的rpa引物序列如seq id no.33和34所示。
13、本专利技术第三方面，提供了本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于CRISPR/Gs12系统介导的多重核酸检测试剂盒，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述Gs12-1核酸酶的crRNA中scaffold序列如SEQ ID NO.22所示，所述Gs12-4核酸酶的crRNA中scaffold的序列如SEQ ID NO.23所示，所述Gs12-9核酸酶的crRNA中scaffold的序列如SEQ ID NO.24所示，所述Gs12-18核酸酶的crRNA中scaffold的序列如SEQ ID NO.25所示。
3.基于CRISPR/Gs12系统介导的多重检测塞内卡病毒、猪瘟病毒以及非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，包括：
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括用于扩增塞内卡病毒VP1基因、猪瘟病毒E2基因以及非洲猪瘟病毒P72基因的引物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述用于扩增塞内卡病毒VP1基因的RPA引物序列如SEQ ID NO.29和30所示，所述用于扩增猪瘟病毒E2基因的RPA引物序列如SEQID NO.31和32所示，
6.根据权利要求3至5中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述Gs12核酸酶为Gs12-1、Gs12-4及Gs12-18核酸酶。
7.基于CRISPR/Gs12系统介导的双重可视化检测塞内卡病毒及非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，包括：
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包括用于扩增塞内卡病毒VP1基因以及非洲猪瘟病毒P72基因的引物。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述用于扩增塞内卡病毒VP1基因的RPA引物序列如SEQ ID NO.29和30所示，所述用于扩增非洲猪瘟病毒P72基因的RPA引物序列如SEQ ID NO.33和34所示。
...【技术特征摘要】
1.一种基于crispr/gs12系统介导的多重核酸检测试剂盒，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述gs12-1核酸酶的crrna中scaffold序列如seq id no.22所示，所述gs12-4核酸酶的crrna中scaffold的序列如seq id no.23所示，所述gs12-9核酸酶的crrna中scaffold的序列如seq id no.24所示，所述gs12-18核酸酶的crrna中scaffold的序列如seq id no.25所示。
3.基于crispr/gs12系统介导的多重检测塞内卡病毒、猪瘟病毒以及非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，包括：
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括用于扩增塞内卡病毒vp1基因、猪瘟病毒e2基因以及非洲猪瘟病毒p72基因的引物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述用于扩增塞内卡病毒...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢胜松，赵书红，李新云，陶大刚，徐兵荣，阮进学，
申请(专利权)人：湖北洪山实验室，
类型：发明
国别省市：
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