【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病毒反向遗传，具体涉及在vero中拯救优化cva10病毒的质粒、方法和应用。
技术介绍
1、手足口病（hfmd）是一种全球范围内的具有高度传染性的病毒性疾病，主要影响婴幼儿。cva10病毒是引起手足口病的主要病原体之一，目前，还没有可以临床应用的cva10病毒疫苗，开发针对cva10的新型减毒活疫苗，对hfmd的预防和控制有重大意义。
2、cva10病毒感染导致的手足口病通常表现为轻度和自限性症状，包括发热、口腔溃疡以及手足臀轻微水疱或小溃疡，但是仍有少数病例会出现各种严重的临床症状，如甲癣、疱疹性咽峡炎、高ck血症、中枢神经系统并发症，甚至死亡。先前的流行病学研究表明，几十年来ev71和cva16一直是全球手足口病的主要病原体，但近年来，随着ev71疫苗的上市，手足口病的流行谱发生了变化。但是ev71疫苗对其它肠道病毒血清型不具有交叉保护作用，导致cva10感染的增多。
3、目前，研究人员试图采用不同的方法开发cva10 疫苗，这些疫苗都还处于实验室研究阶段，例如传统的灭活病毒疫苗（甲醛灭活或β丙内酯灭活）、病毒样颗粒（vlp）和亚单位疫苗。ev71、cva6和cva16疫苗毒株，一般要求疫苗株不能使用肿瘤细胞从临床样本中分离，但使用疫苗生产用细胞vero从临床样本中直接分离cva10非常困难。除了vero 细胞适应的 cva10/s0148b 菌株外，大部分cva10为rd分离株，不能很好地满足疫苗开发的要求。除此之外，传统的灭活cva10病毒疫苗，在生产过程中会出现较多的病毒空颗粒，病
技术实现思路
1、本专利技术提供了在vero中拯救优化cva10病毒的重组质粒、方法和应用，在vero细胞上成功拯救了优化的cva10病毒（co-cva10病毒），且拯救的co-cva10病毒与野生cva10病毒具有相似的生物学特性。
2、本专利技术提供了含cva10病毒基因组的重组质粒，所述重组质粒的骨架结构包括t7启动子、优化的cva10病毒基因组、polya尾、线性化酶切位点bglⅱ和t7终止子。
3、优选的，所述重组质粒的骨架结构中，在t7启动子和优化的cva10病毒基因组之间还包括顺式锤头核酶hhrib。
4、所述优化的cva10病毒基因组来源于cva10病毒候选疫苗株k6-19/xy/chn/2017（mt828547.1）经三代测序后得到的病毒最完整基因组，获得mt828547.1中未包括的5'和3'utr序列。同时将mt828547.1的编码序列（coding sequences，cds）根据vero细胞的密码子和表达特性进行了优化。组装测序获得的最完全5'和3'utr序列和优化后的cds序列，最后获得全新的vero优化株适应株。
5、优选的，所述重组质粒的基本质粒骨架包括puc-gw-kan或pcdna3.1。
6、本专利技术还提供了上述重组质粒在vero细胞上拯救优化株co-cva10病毒的应用。
7、优选的，包括利用体外转录法或体内转录法，在所述vero细胞上拯救所述优化株co-cva10病毒。
8、本专利技术还提供了一种利用体外转录在vero细胞上拯救优化株cva10病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：利用上述重组质粒酶切线性化后进行体外转录获得感染性rna，利用所述感染性rna转染至vero细胞中进行病毒拯救，得拯救的优化株cva10病毒。
9、本专利技术还提供了利用上述体外转录方法拯救得到的优化株cva10病毒。
10、本专利技术还提供了一种利用体内转录在vero细胞上拯救优化株cva10病毒的方法，包括以下步骤：利用上述重组质粒与含t7 rna聚合酶的质粒共转至vero细胞进行病毒拯救，得拯救的优化株cva10病毒。
11、本专利技术还提供了利用上述体内转录方法拯救得到的优化株cva10病毒。
12、本专利技术还提供了上述拯救得到的cva10病毒在制备优化株cva10疫苗中的应用。
13、有益效果：本专利技术通过三代测序获得了cva10的完整基因组，经密码子优化后利用反向遗传学设计并合成了含co-cva10病毒基因组的质粒。
14、本专利技术所述质粒，可满足vero细胞平台进行病毒拯救的要求，即可通过：①体外转录方案，转染病毒的感染性 rna至vero细胞拯救病毒；②体内转录方案，将含t7启动子的病毒质粒和t7 rna聚合酶质粒共转至vero细胞，让病毒质粒在体内转录为病毒rna基因组，从而拯救病毒。
15、经本专利技术所述方法，从vero细胞中拯救得到的优化株优化株cva10病毒、优化病毒co-cva10与野生cva10病毒具有相似的生物学特性。因此，本专利技术可得到由vero细胞拯救的、活的cva10病毒，通过反向遗传学技术，解决了cva10病毒不能在vero细胞上生产的困境，有望解决上述cva10疫苗开发中面临的困难，从而预防手足口病，惠利于民。
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1.含CVA10病毒基因组的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的骨架结构包括T7启动子、经密码子优化的CVA10病毒基因组、polyA尾，线性化酶切位点BglⅡ和T7终止子。
2.根据权利要求1所述重组质粒，其特征在于，所述经密码子优化的CVA10病毒基因组包括以CVA10病毒候选疫苗株K6-19/XY/CHN/2017经三代测序后得到的病毒最完整基因组为模板，根据Vero细胞的密码子和表达特性进行优化得到的基因组。
3.根据权利要求1或2所述重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的基本质粒骨架包括pUC-GW-Kan或pcDNA3.1。
4.权利要求1~3任一项所述重组质粒在Vero细胞上拯救优化株CO-CVA10病毒的应用。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，包括利用体外转录法或体内转录法，在所述Vero细胞上拯救所述优化株CO-CVA10病毒。
6.一种利用体外转录在Vero细胞上拯救优化株CO-CVA10病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1~3任一项所述重组质粒酶切线性化后进行体外转录获得感染性R
7.利用权利要求6所述方法拯救得到的优化株CO-CVA10病毒。
8.一种利用体内转录在Vero细胞上拯救优化株CO-CVA10病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1~3任一项所述重组质粒与含T7 RNA聚合酶的质粒共转至Vero细胞进行病毒拯救，得拯救的优化株CO-CVA10病毒。
9.利用权利要求8所述方法拯救得到的优化株CO-CVA10病毒。
10.权利要求7或权利要求9所述优化株CO-CVA10病毒在制备CO-CVA10疫苗中的应用。
...【技术特征摘要】
1.含cva10病毒基因组的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的骨架结构包括t7启动子、经密码子优化的cva10病毒基因组、polya尾，线性化酶切位点bglⅱ和t7终止子。
2.根据权利要求1所述重组质粒，其特征在于，所述经密码子优化的cva10病毒基因组包括以cva10病毒候选疫苗株k6-19/xy/chn/2017经三代测序后得到的病毒最完整基因组为模板，根据vero细胞的密码子和表达特性进行优化得到的基因组。
3.根据权利要求1或2所述重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的基本质粒骨架包括puc-gw-kan或pcdna3.1。
4.权利要求1~3任一项所述重组质粒在vero细胞上拯救优化株co-cva10病毒的应用。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，包括利用体外转录法或体内转录法，在所述vero细胞上拯救所述优化株co-cv...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙浩，张小超，李禹霏，马绍辉，李赵清，张瑶，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：
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