【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物病理学，具体为一种基于分子标记的芝麻枯萎病鉴定方法。
技术介绍
1、芝麻作为一种重要的油料作物，在全球范围内广泛种植，但是芝麻枯萎病的频繁发生给芝麻的产量和品质带来了严重威胁，芝麻枯萎病是由多种病原菌引起的病害，其发病过程复杂，早期症状不明显，一旦病情加重，往往会导致芝麻植株大面积死亡，给种植户带来巨大的经济损失，因此，准确、快速地鉴定芝麻枯萎病对于及时采取防治措施、保障芝麻生产至关重要。
2、然而，在芝麻枯萎病的鉴定方法中，传统的形态学观察和病原菌分离培养方法，在形态学观察往往依赖于经验丰富的专业人员，主观性较强，且在病害早期难以准确判断，病原菌分离培养则耗时较长，操作复杂，容易受到环境因素的干扰，而现有的基于分子标记的鉴定方法，大多采用常规的dna片段或短链rna作为分子标记，这些分子标记在特异性和灵敏度方面存在不足，与其他病害和非病害状态下的芝麻植株存在一定的交叉反应，导致误判，同时，传统的鉴定方法通常采用已知的蛋白质编码基因作为标记，这些方法往往不能精确地反映疾病的早期状态。
3、综上所述，现有的芝麻枯萎病鉴定方法难以满足实际生产中对芝麻枯萎病快速、精准鉴定的需求，因此，开发一种新的基于特定长链非编码rna作为分子标记的芝麻枯萎病鉴定方法具有重要的现实意义，为芝麻枯萎病的防治提供更加可靠的技术支持。
技术实现思路
1、本专利技术的目的就是为了弥补现有技术的不足，提供了一种基于分子标记的芝麻枯萎病鉴定方法，它能够通过采用特定长链非编码
2、本专利技术为解决上述技术问题，提供如下技术方案：一种基于分子标记的芝麻枯萎病鉴定方法，该鉴定方法包括以下步骤：
3、s100，rna提取与纯化：从待测芝麻样本中提取总dna和蛋白质污染rna，采用高效的rna提取试剂盒，对提取的rna进行纯化，通过去除存在的杂质和抑制剂，以保证后续反转录和pcr扩增的效率；
4、s200，反转录与cdna合成：利用反转录试剂盒，将纯化后的rna反转录为cdna，在反转录过程中，使用针对lncrna-x123设计的特异性引物和酶，对合成的cdna进行质量检测和浓度测定，通过电泳法，使其满足pcr扩增的要求；
5、s300，pcr扩增与产物检测：合成针对特定lncrna的引物对准确扩增出目标lncrna片段，以cdna为模板，利用特定的引物对进行pcr扩增，通过优化pcr反应条件，对扩增产物进行质量检测，包括产物大小、纯度和浓度；
6、s400，测序与数据分析：对扩增产物进行测序，得到特定lncrna的序列信息，与已知的芝麻枯萎病相关lncrna序列进行比对和分析，对测序结果进行质量控制，以得到准确的鉴定结果；
7、s500，鉴定结果判断：根据比对结果，判断待测芝麻样本是否感染枯萎病，测序结果与已知的芝麻枯萎病相关lncrna序列一致，则判断待测芝麻样本感染枯萎病，并设置多个特定的lncrna分子标记进行联合鉴定，检验鉴定的灵敏度和特异性。
8、更进一步地，所述s100的具体步骤为：
9、s101，样本准备与组织破坏：选取健康的和已知感染枯萎病的芝麻植株作为待测样本，迅速冷冻保存在液氮中，将冷冻的芝麻组织取出，在液氮中研磨成粉末状；
10、s102，rna提取：使用rna提取试剂盒trizol试剂，加入裂解液到研磨后的组织中，使细胞裂解并释放出rna，通过离心操作去除细胞碎片和不溶物，得到含有rna的上清液，使用紫外分光光度计测定rna浓度和纯度；
11、s103，去除dna污染：在上清液中加入dna酶，以去除残留的dna，通过热失活和加入抑制剂方法使dna酶失活；
12、s104，rna纯化：使用柱状纯化试剂盒进一步纯化rna，去除提取过程中产生的杂质和抑制剂，通过紫外分光光度计再次测定纯化后的rna浓度和纯度；
13、s105，rna沉淀与洗涤：加入异丙醇和乙醇沉淀剂，使rna沉淀下来，通过离心收集rna沉淀，并用75％乙醇洗涤以去除残留的盐和小分子杂质。
14、更进一步地，所述s100rna提取与纯化通过紫外分光光度计测定rna的a260/a280比值和a260/a230比值，以评估rna的纯度，其中，对于a260/a280比值接近2.0，a260/a230比值接近2.0-2.2时，认为rna质量良好，将提取和纯化后的rna储存在-80℃条件下，以防止rna降解并为反转录和pcr扩增使用。
15、更进一步地，所述s200反转录与合成的具体步骤为：
16、s201，反转录体系准备：根据反转录试剂盒准备反转录所需的反应体系，包括反转录酶、针对lncrna-x123设计特异性引物、rna酶抑制剂、脱氧核糖核苷三磷酸以及缓冲液；
17、s202，rna模板加入：将纯化后并经过质量评估的rna样本加入到反转录体系中；
18、s203，反转录反应：对含有rna模板的反转录体系设置反应条件，进行反转录反应，使rna完全反转录为cdna；
19、s204，cdna质量评估与浓度测定：对反转录得到的cdna进行初步的质量评估，使用分光光度计测定cdna的浓度，同时，利用琼脂糖凝胶电泳观察cdna的完整性和大小分布，检查是否有降解和非特异性产物的存在；
20、s205，cdna存储：将质量合格的cdna样本存储在-20℃，以防止降解并备pcr扩增使用。
21、更进一步地，所述s203反转录反应将纯化后的rna样品与特异性引物混合，并按照反转录试剂盒加入反转录酶，设置反转录反应条件为65℃，预热为5分钟以使rna变性，随后置于冰上冷却，进行反转录反应设置反应温度和时间为42℃和1小时，并70℃加热15分钟以终止反应，通过s204使用紫外分光光度计测定cdna的浓度和纯度，使cdna的a260/a280比值接近2.0，即cdna纯度较高，通过琼脂糖凝胶电泳检查cdna的质量，确保没有降解现象。
22、更进一步地，所述s300pcr扩增与产物检测的具体步骤为：
23、s301，pcr反应体系准备：在无菌的pcr管中，依次加入cdna模板、特异性引物对、dna聚合酶、缓冲液、dntps和无菌水，组成pcr反应体系；
24、s302，pcr反应条件设置：根据引物和dna聚合酶的特性，设置pcr反应条件，包括预变性温度和时间、变性温度和时间、退火温度和时间、延伸温度和时间以及循环次数；
25、s303，pcr扩增反应：将pcr反应体系放入pcr仪中，设定的反应条件进行扩增反应，观察pcr本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于分子标记的芝麻枯萎病鉴定方法，其特征在于，该鉴定方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述一种基于分子标记的芝麻枯萎病鉴定方法，其特征在于，所述S100的具体步骤为：
3.根据权利要求2所述一种基于分子标记的芝麻枯萎病鉴定方法，其特征在于，所述S100RNA提取与纯化通过紫外分光光度计测定RNA的A260/A280比值和A260/A230比值，以评估RNA的纯度，其中，对于A260/A280比值接近2.0，A260/A230比值接近2.0-2.2时，认为RNA质量良好，将提取和纯化后的RNA储存在-80℃条件下，以防止RNA降解并为反转录和PCR扩增使用。
4.根据权利要求1所述一种基于分子标记的芝麻枯萎病鉴定方法，其特征在于，所述S200反转录与合成的具体步骤为：
5.根据权利要求4所述一种基于分子标记的芝麻枯萎病鉴定方法，其特征在于，所述S203反转录反应将纯化后的RNA样品与特异性引物混合，并按照反转录试剂盒加入反转录酶，设置反转录反应条件为65℃，预热为5分钟以使RNA变性，随后置于冰上冷却，进行反转录反应设置反
6.根据权利要求1所述一种基于分子标记的芝麻枯萎病鉴定方法，其特征在于，所述S300PCR扩增与产物检测的具体步骤为：
7.根据权利要求6所述一种基于分子标记的芝麻枯萎病鉴定方法，其特征在于，所述S303PCR扩增反应设置PCR扩增条件为94℃预变性5分钟、94℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸1分钟、重复35个循环、以72℃延伸5分钟以完成终延伸，将配置好的PCR反应体系放入PCR仪中进行扩增，并将PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为100V电压下运行30分钟，记录条带的位置和清晰度，以评估产物的纯度。
8.根据权利要求1所述一种基于分子标记的芝麻枯萎病鉴定方法，其特征在于，所述S400测序与数据分析选取测序深度、碱基质量分布均匀度、低质量碱基比例作为评估指标，通过计算不同位置的碱基质量对鉴定结果进行质量控制，即对原始测序数据进行预处理，包括去除接头序列、过滤掉低质量的碱基，计算相邻碱基间的相关性以及每个碱基的背景频率，提高测序数据的质量评估精度，其公式为：P(e|i)是在位置i上发生错误的概率，F(bi)碱基b在位置i的背景频率，δ是权重因子，用于调整相邻位置碱基错误概率的影响程度，η是权重因子，用于调整相邻位置碱基背景频率的影响程度，Q(i)是位置i的新质量评分，通过考虑读段长度和位置偏差因素，更准确地估计每个位置的错误概率，即P(e|i)＝αe-β|i-μ|+γ，α是影响错误概率的基础值，β是控制位置偏差对错误概率的影响程度，γ代表背景错误率，μ读段的中心位置，引入一个读段长度的函数L(i)，读段长度对错误率的影响，即Lmax是读段的最大长度，通过考虑读段长度对错误率的影响，准确估计错误率。
9.根据权利要求8所述一种基于分子标记的芝麻枯萎病鉴定方法，其特征在于，所述S400测序与数据分析通过考虑碱基的影响，准确地估计每个位置的背景频率，即F(bi)＝F0(bi)×(1+ω1F1(bi-1)+ω2F2(bi+1))，F0(bi)为没有影响的基本背景频率，F1(bi-1)是前一个碱基的背景频率，F2(bi+1)使后一个碱基的背景频率，ω1和ω2调节影响强度的权重因子，将上述算法应用于测序数据上，计算每个读段中每个碱基的新质量评分，比较同一读段中不同位置的质量评分。
10.根据权利要求1所述一种基于分子标记的芝麻枯萎病鉴定方法，其特征在于，所述S500鉴定结果判断的具体步骤为：
...【技术特征摘要】
1.一种基于分子标记的芝麻枯萎病鉴定方法，其特征在于，该鉴定方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述一种基于分子标记的芝麻枯萎病鉴定方法，其特征在于，所述s100的具体步骤为：
3.根据权利要求2所述一种基于分子标记的芝麻枯萎病鉴定方法，其特征在于，所述s100rna提取与纯化通过紫外分光光度计测定rna的a260/a280比值和a260/a230比值，以评估rna的纯度，其中，对于a260/a280比值接近2.0，a260/a230比值接近2.0-2.2时，认为rna质量良好，将提取和纯化后的rna储存在-80℃条件下，以防止rna降解并为反转录和pcr扩增使用。
4.根据权利要求1所述一种基于分子标记的芝麻枯萎病鉴定方法，其特征在于，所述s200反转录与合成的具体步骤为：
5.根据权利要求4所述一种基于分子标记的芝麻枯萎病鉴定方法，其特征在于，所述s203反转录反应将纯化后的rna样品与特异性引物混合，并按照反转录试剂盒加入反转录酶，设置反转录反应条件为65℃，预热为5分钟以使rna变性，随后置于冰上冷却，进行反转录反应设置反应温度和时间为42℃和1小时，并70℃加热15分钟以终止反应，通过s204使用紫外分光光度计测定cdna的浓度和纯度，使cdna的a260/a280比值接近2.0，即cdna纯度较高，通过琼脂糖凝胶电泳检查cdna的质量，确保没有降解现象。
6.根据权利要求1所述一种基于分子标记的芝麻枯萎病鉴定方法，其特征在于，所述s300pcr扩增与产物检测的具体步骤为：
7.根据权利要求6所述一种基于分子标记的芝麻枯萎病鉴定方法，其特征在于，所述s303pcr扩增反应设置pcr扩增条件为94℃预变性5分钟、94℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸1分钟、重复35个循环、以72℃延伸5分钟以完成终延伸，将配置好的pcr反应体系放入pcr仪中进行扩增...
【专利技术属性】
技术研发人员：阴长发，段灵涛，陈洪凡，王希，邓兴，黄蓉，常晓珂，兰波，杨迎青，
申请(专利权)人：江西省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：
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